摘要：目的：利用外源性基因改变肿瘤原有的放射耐受性使其对放疗敏感，从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供实验依据。方法：利用本实验室构建的含腺病毒（Ad5）早期表达基因EIA的pCDNA3－E1A重组质粒转染肺腺癌Anip－973细胞，G418筛选后，经PCR，RT－PCR和免疫细胞化学染色鉴定，获得含EIA的阳性克隆。将未转染的Anip－973细胞、转染空载体质粒的Anip－973细胞和转染EIA的Anip－973细胞取0、1、2、3、5、7、10GY剂量点，用6MV的X线单次照射以制作放射存活曲线；5GY单次照射后不同时间用MTT法测细胞存活。结果：①转染后的阳性克隆细胞PCR，RT－PCR和免疫细胞化学染色结果说明：EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②细胞放射存活曲线结果显示：未转染的Anip－973细胞Do=1.14，Dq=1.53；空载体转染后的Anip－973细胞Do=1.13，Dq=1.44；EIA转染后的Anip－973细胞Do=1.02，Dq=0.8。未转染及空载体转染后的Anip－973细胞照射后细胞存活无明显差异，而EIA转染后的Anip－973细胞照射后细胞存活明显下降，存活曲线的肩区变窄，Dq值降低。③5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活以14小时最低，未转染的Anip－973细胞与转染EIA的Anip－973细胞14小时存活率分别为：69.5％、41.5％。经t检验均有显著差异。结论：本实验的结果证实EIA使Anip－973细胞照射后的间期死亡和增殖死亡均提高，使细胞的放射敏感性增加。

分类号：R73－76文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)03－0197－03

Effect of EIA gene on tumor cell radiosensitivity

ZHANG Da－xinQIAN xin－laiZHAO qing－zhenget al.

（Department of Radiation Oncology， cancer Hospital， Chinese academy of Medical Sciences， Peking Union medical College， Beijing 100021， P.R.China.）

Abstract：Objective： to test if EIA gene is able to increase radiosensitivity of tumor cells. Methods： pcDNA3 vector with EIA gene (pcDNA3－EIA) was transfected into human lung cancer cells (Anip－973)， then the transfected cells were selected using G418， the positive colones were identified by PCR， rT－PCR and immunocytochemical methods， Anip－973 cells， and cells transfected with pcDNA3 vector (Anip973－vect cells) and transfected with pcDNA3－EIA (Anip973－E1A－cells) were irradiated with 0GY， 1GY， 2GY，3GY， 5GY，7GY， 10GY respectively using 6MV X ray. Above three cell lines were also given 5GY irradiation respectively， survival ratios of these cells were analyzed timely with MTT method. Results： PCR， rT－＊PCR and immunocytochemical method confirmed that EIA gene has integrated into positive transfected cells and stably expressed. Cell radiation－survival curve showed that Do and Dq value in Anip－973 cell， Anip973－vect cells and Anip973－E1A were 1.14， 1.13，1.02 and 1.53， 1.44，0.8， respectively. the curve of Anip－973 cells and Anip973－vect cells did not show difference， but Anip973－EIA cells showed narrow shoulder region， and steeply fell. 5GY－irradiated cells showed the lowest survival at 14 hour， survival rate in Anip－973 cells and Anip973－EIA cells were 69.5％ and 41.5％(P＜0.05). Conclusions： Both interphase death and proliferative death of the tumor cells were enhanced significantly by EIA gene. Thus， introducing EIA gene into tumor cells may be a useful approach to improve the effect of radiotherapy.

Key words：EIA gene； radiosensitization； Tumor cell▲

随着分子生物学的发展，人们越来越多的认识到，肿瘤的放射敏感性与其内在的分子生物学机制密切相关。目前，已发现许多癌基因和抑癌基因的异常表达可影响肿瘤细胞的程序性死亡、放射敏感性和预后，但是有些基因与肿瘤的放射敏感性和预后的确切关系还不清楚^[1]。因此，有必要对肿瘤放射敏感性的分子生物学机制做进一步的研究，以确定肿瘤对放射治疗抗拒的内在原因，同时利用分子生物学的研究成果对肿瘤的放射敏感性进行调控，以提高肿瘤的治疗效果。本文报告利用腺病毒早期表达基因EIA转染人肺腺癌细胞，观察了EIA转染后该细胞的放射敏感性变化。

1材料和方法

1.1细胞及培养

采用具有p53突变型的人肺腺癌细胞系Anip-973（哈尔滨医科大学细胞生物教研室提供）^[2]。培养条件为含10％小牛血清的PRMI-1640培养基，5％CO₂孵箱37℃。

1.2细胞转染

取70％融合态的Anip-973细胞，将含EIA的pCDNA3-E1A重组质粒（本实验室构建）^[3]及空载体pCDNA3质粒分别与脂质体1∶3混和后，无血清条件下培养10小时，加20％血清继续培养到24小时，换含10％小牛血清的1640培养48小时后加G418筛选，待单个克隆形成后取单克隆细胞G418继续筛选扩增。

1.3转染后的阳性克隆鉴定

1.3.1PCR检测转染后细胞的neo基因：基因组DNA提取后定量将特定引物和底物混和成反应混合物，neo基因引物为：引物1：5-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3；引物2：5-CCGCTCAGAAGAACTCGTC-3。反应条件为：95℃变性1分钟→60℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，32个循环后72℃延伸10分钟。

1.3.2RT-PCR检测转染后细胞的EIA表达：细胞总RNA的提取按Trizol试剂盒说明书，cDNA第一条链的合成按GIBcol-BRL公司说明书，将制备好的cDNA及特定引物制成反应混合物。EIA基因的引物为：引物1：5-CGGAGGTGTTATTACCGAAG-3：引物2：5-TCGTCACTGGGTGGAAAGCC-3。反应条件为：93℃变性1分钟→59℃退火1分钟→72℃延伸2分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。将得到的扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

1.4免疫细胞化学染色

采用S－P法检测转染前后Anip-973细胞EIA基因的蛋白表达情况。

1.5照射条件

用6MV的X线室温照射细胞，源皮距100cm，照射细胞培养瓶/板上放置1.5cm厚的蜡板。

1.6照射细胞存活曲线

设0GY、1GY、2GY、3GY、5GY、7GY、10GY剂量点，细胞消化后制成悬液，接种细胞，每个剂量点3瓶细胞，待细胞贴壁后照射。照射后细胞培养13天，无水乙醇固定细胞，按＞50个细胞为一个克隆计数克隆，计算细胞存活率，计算机按单靶多击模型拟合，绘制细胞存活曲线，求Do值、Dq值。

1.7MTT法测单次照射后细胞存活

96孔板接种细胞，每孔2×10⁴个，每个时间点6孔，培养48小时后照射。未照射和照射后细胞在5％CO₂孵箱37℃孵育后，按时间顺序以10∶1的体积加MTT（5mg/ml），作用4小时后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解，37℃孵育待紫色固体凝粒溶解均匀后，酶标仪测OD490值。用各时间点的OD值除以培养48小时未照射对照组的OD值得各时间点的存活率。

2结果

2.1转染后的阳性克隆细胞鉴定结果

PCR及RTPCR产物电泳结果见图1A和1B，EIA蛋白表达见图1C。说明EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。

图1A扩增neo基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果

1：Anip973DNA;2：Anip973-vectDNA;

3、4：Anip973-E1ADNA;5：Conteol;

6：lambdaDNA/HindⅢMarkers

图1BE1A基因的RT-PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳分析结果

1：Control;2、4、7:Anip973-E1A；3：Anip973；

5：Anip973-vect;6：阴性对照；

8：pBR322DNA/BstN1Markers

图1C转染后E1A蛋白表达免疫细胞化学染色结果(×400)

2.2细胞存活曲线

未转染的Anip-973细胞和EIA转染后的Anip-973细胞及空载体pCDNA3转染后的Anip-973细胞照射后的细胞存活曲线：见图2。

图2Anip-973未转达染及转染EIA和空栽体后放射生<