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中图分类号：R739.63文献标识码：A
文章编号：1000-467X（2000）02-0101-03
Identification of an EST down－regulated in nasopharyngeal carcinoma at chromosome 3p14.2
TIAN FangLI You－junCHEN Zhu－chuet al.
（Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078， P. R. China ）
【Abstract】 Objective: To identify the expressed sequence tags (EST) associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) at chromosome 3p14.2 for cloning of candidate gene(s) at the loci. Methods: Using ESTs homology analysis in bioinformatics combined with Northern blots and reverse transcription－PCR, the expression of relative ESTs at 3p14.2 was detected in nasopharyngeal carcinoma tissues in comparison with normal nasopharyngeal epithelia. Results: Comparing with expression of normal nasopharyngeal epithelia, EST w23312 was down－regulation in nasopharyngeal carcinoma cell line and five of thirteen nasopharyngeal biopsies（ P＜0.01） . Conclusion: W23312 is down－regulation in NPC. It may play a role in NPC carcinogenesis and provide a new clue in cloning of NPC associated gene(s).
Key words: Expressed sequence tag; Nasopharyngeal carcinoma; 3p14.2; Gene expression
鼻咽癌（nasopharygeal carcinoma,NPC）是一种上皮源性的恶性肿瘤，在华南地区、东南亚一带发病率较高。同许多其它肿瘤一样，NPC也是一个多基因多阶段作用的结果，涉及多种瘤基因、抑瘤基因的改变,如瘤基因c－myc、ras和bcl－2在NPC中过表达，而已知抑瘤基因p53、p16和pRb2在NPC发生发展中也可能起一定作用[1,2]。目前这种疾病的确切分子机制仍不很清楚。有研究显示NPC存在以下高频率杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）位点：3p14－25、9p、11q等[3,4,5]，提示这些区域存在某种或某些未知的NPC相关基因，尤其是3p14.1－p14.3区域杂合性丢失高达50％～70％，提示该区域定位有与鼻咽癌密切相关的抑瘤基因。我们利用现存大量表达序列标记（expressed sequence tag，EST）资源，从NPC高频率LOH位点3p14区域的EST着手,应用Northern杂交和逆转录PCR（RT－PCR）方法，筛选、鉴定与鼻咽癌相关cDNA片段。
1材料与方法
1.1EST的筛选
我们从美国9家生物技术信息中心（NCBI）的EST数据库入手，首先在UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/index.html)中查找3号染色体的ESTs，有42,000多条ESTs需要筛选。为了缩小搜寻范围，靠近目标区域，又在EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/EST)中输入染色体区带信息，查找3p区域ESTs，找到几十条ESTs。利用GCG（Genetic Computer Groups,USA）的Seqlab软件包（又称Wisconcin Package）及基于Internet的数据库和分析系统对这几十条EST进行比较、分析，剔除代表已克隆基因的ESTs。选择的标准是：(1)与已知基因同源性约50％～85％，(2)EST长度至少在二百个碱基对以上，(3)代表未克隆基因，(4)尽可能来源于染色体3p14.2－14.3区域，(5)有关于染色体定位信息的说明；最后筛选到13个满足以上条件的ESTs。首先选取6个ESTs进行PCR扩增，回收送ABI377测序仪测序证实，再将它们做成探针，用于Northern blot筛选。
1.2标本
人胚来自湖南医科大学附属第一、第二、第三医院产科水囊引产胚胎，胎龄20～28周，在无菌环境下分离人胚鼻咽上皮组织，原代培养，并去成纤维细胞。人胚胰腺、小肠、皮肤、肾、肺、心肌、大脑、气管、口颊粘膜均直接取材后立即冻存于液氮中。CNE2细胞株为一株成人鼻咽低分化鳞癌细胞株，由本所提供、培养。正常成人鼻咽上皮及鼻咽癌活检组织由湖南医科大学附属第二医院耳鼻喉科提供；正常成人鼻咽上皮病理活检为鼻咽慢性炎症改变（作为正常对照），鼻咽癌均为低分化鳞癌。标本取材后置液氮内速冻、保存。
1.3总RNA提取
用TRIzolReagentTM试剂（购自Life Technologies公司）抽提原代培养人胚鼻咽上皮细胞和人胚胰腺、小肠、皮肤、肾、肺、口颊粘膜、气管、脑、心肌组织，CNE2细胞株及正常成人鼻咽上皮和鼻咽癌活检组织中的总RNA。活检组织先于液氮制冷下，在碾钵中将其碾碎，再加入TRIzol试剂，按说明书操作。
1.4探针制备
PCR扩增合成ESTs探针，6％中性聚丙烯酰胺凝胶电泳回收纯化目标片段[6]，送PE公司ABI377测序仪测序证实。用PCR法以同位素α－P32－dATP标记探针。PCR反应条件：94℃变性，2分钟；循环程序：94℃30秒，68℃30秒，72℃45秒，30个循环；72℃,5分钟;4℃,保温。PE480机上进行。内对照β－actin探针（购自CLONTECH公司）用随机引物标记试剂盒（B.M.）以α－P32－dCTP标记，按说明书操作。
1.5Northern杂交
RNA电泳按“分子克隆实验指南”[6]操作程序进行。转膜用BioRad公司785型真空转膜仪转膜2小时，压力5mmHg；80℃真空干烤2小时。65℃预杂交、杂交按“分子克隆实验指南”[6]操作程序进行。杂交液成分为5XDenharts,6XSSC,0.5％SDS,100μg/mlssDNA。洗膜：2XSSC，0.1％SDS，65℃15分钟洗膜2～3次，0.1XSSC，0.1％SDS15分钟洗膜1次。－70℃放射自显影24小时或36小时后洗片。同时用内对照β－actin探针杂交。
1.6RT－PCR
提取26对鼻咽癌活检组织（NPC组）及正常成人鼻咽上皮（对照组）的总RNA，经DNaseI（BM公司）37℃消化痕量DNA，苯酚、氯仿抽提后再应用逆转录试剂盒（Promega公司）进行逆转录。尔后取逆转录产物5μl进行PCR反应，每管PCR中均同时加入内对照(GAPDH)引物和目标片段w23312引物，反应参数为94℃30秒，65℃30秒，72℃55秒，30个循环。30个循环为进入平台期前的循环数（数据未显示）。PCR产物点样于1.5％琼脂糖凝胶上，EB染色。电泳结果经GelDoc1000(Bio Rad公司)扫描分析仪通过光密度扫描计算曲线中各峰下面积及其比值。测定结果应用统计学软件SPSS中oneway ANOVA分析进行组间比较。
2结果
探针测序证实与w23312一致。见图1。
图1w23312探针测序图
w23312在多种人胚胎组织中的表达谱，各组织RNA量约为12～20μg。在胚口颊粘膜、胰腺、鼻咽、小肠、气管、皮肤、肾、心肌均有一约2.4kb杂交信号，在胚口颊粘膜、胰腺、鼻咽、心肌还有一约1.5kb杂交信号，可能是另一种转录本。胚肺、大脑未检测到杂交信号。见图2。
图2w23312探针与多种人胚胎组织RNA杂交结果。
1:胚口颊粘膜2:胚胰腺3:胚鼻咽4:胚小肠5:胚气管
6:胚皮肤7:胚肾8:胚肺9:胚大脑10:胚心肌
Northern杂交结果显示w23312在鼻咽癌细胞株CNE2中表达明显下调，在人胚鼻咽上皮及正常成人鼻咽上皮表达较强，在鼻咽组织中存在2个大小分别约为2.4kb和1.5kb转录本。内对照β－肌动蛋白信号一致，表明各泳道RNA量一致。见图3。
图3左:人胚鼻咽上皮、正常成人鼻咽上皮、
CNE2与w23312探针Northern杂交信号。
右:同一张膜与β－肌动蛋白探针杂交信号
1：人胚鼻咽上皮细胞2：正常成人鼻咽上皮3：CNE2
RT－PCR琼脂糖凝胶EB染色后经GelDoc1000扫描、摄像，并运用分子分析软件（molecular analysis software，Bio Rad公司）通过光密度扫描计算曲线中各峰下面积及其比值。结果见图4及表1。如表1所示，两组间GAPDH表达无<
