【摘要】目的:探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白（TGF_α-PE40,简称TP40）对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。方法:用免疫组化LSAB法检测人肺腺癌SPC-A-1细胞表皮生长因子受体（EGFR）的表达，用结晶紫染色法和³H-亮氨酸掺入法检测TP40对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成的抑制，用过量EGF竞争拮抗TP40的细胞毒作用。结果:SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色。TP40浓度为1～100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长及蛋白质合成呈剂量依赖性抑制。过量EGF能完全拮抗TP40的细胞毒作用。结论:人肺腺癌SPC-A-1细胞能高水平地表达EGFR，重组TP40对SPC-A-1细胞生长具有较强的抑制作用，作用部位为细胞的EGFR。

中图分类号：R734.2；R73－36文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)02－0143－03

Growth inhibitory effect of TGF_α－PE40 on human lung adenocarcinoma cells

WANG BingXU Yong-huaWANG Jie-junet al

（Department of Oncology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,P.R.China）

【Abstract】 Objective: To investigate growth inhibit effect of recombinant transforming growth factor α-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGF_α-PE40;TP40) on cultured human lung adenocarcinoma cells. Methods: The expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in a human lung adenocarcinoma cell line SPC-A-1 was determined with immunohistochemistry. Inhibitory effects of TP40 on SPC-A-1 cell growth and protein synthesis were analyzed with crystal violet staining and ³H-leucine incorporation. Competitive assay was performed by the addition of excess of EGF. Results:The SPC-A-1 cells appeared large amount of brown immunoperoxidase reaction indicating EGFR positive. When the concentration of TP40 was in the range of 1～ 100 ng/ml, TP40 inhibited SPC-A-1 cell growth and protein synthesis in a dose-dependent manner. Excess EGF can completely block the inhibitory effects of TP40. Conclusions:The human lung adenocarcinoma SPC-A-1 cells express high level EGFR. TP40 can significantly inhibit SPC-A-1 cell growth. The cytotoxic effect of TP40 was specifically mediated by EGFR.

Key words：TGF_α-PE40; Lung adenocarcinoma cells; Epidermal growth factor receptor; Growth inhibitor

肺癌是最常见的肺恶性肿瘤。近半个世纪来，世界各国的发病率和病死率急剧上升。肺癌目前的治疗是以手术、放疗、化疗和免疫治疗为主的综合治疗，平均5年生存率仅10％左右。本研究拟探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白（TGF_α-PE40，简称TP40）对人肺腺癌细胞生长的导向抑制作用。

1材料与方法

1.1主要试剂

基因重组TP40:中国科学院上海细胞生物学研究所徐永华教授合成并提供。兔抗人表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor,EGFR）单克隆抗体:Sigma公司产品。LSAB组合试剂盒，Dako公司产品。3H亮氨酸:Amersham公司产品。表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)与酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,aFGF):上海市第一人民医院心内科张建军博士惠赠。PRMI1640培养基:Gibco公司产品。

1.2人肺腺癌细胞株及培养

人肺腺癌SPC-A-1细胞株:购自中国科学院上海细胞生物学研究所。培养于含10％小牛血清的1640培养液中，培养液另含4mmol/L谷氨酰胺，青、链霉素(各为100IU/ml,100μg/ml),置于5％CO₂孵箱内。

1.3肺腺癌细胞EGFR的表达

用盖玻片培养SPC-A-1细胞，4％多聚甲醛固定后，按LSAB法进行^[1]。

1.4TP40对肺腺癌细胞生长的影响

SPC-A-1细胞以5×10³/孔的密度接种96孔板，每组3孔，置37℃CO₂孵箱内温育24h后，加入不同浓度TP40（0.1，1，10，100ng/ml），对照组加入不含TP40的培养液。继续温育24h后取出，在结晶紫固定液中浸染20min，然后用去离子水荡洗，浸泡15min，待自然晾干后，每孔加入100μl结晶紫提取液，于595nm处测定吸收度值（OD值）^[2]。

1.5TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响

细胞接种及TP40加入浓度同上。细胞与TP40温育24h后，加入³H-亮氨酸1.85×10⁴ Bq/孔，继续温育4h后，倾去培养液，D-Hanks液洗涤3次，用0.1％胰蛋白酶消化3min，然后用DYQ-Ⅲ型多头细胞收集仪（绍兴坡塘医疗仪器厂）将细胞收集在玻璃纤维纸上，晾干后80型液体闪烁计数仪(中国科学院上海原子核研究所)测其放射性强度。

1.6EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用

SPC-A-1细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板，每组3孔，CO₂孵箱内温育24h后取出，分别加入EGF及aFGF1μg/ml(剂量为TP40浓度的100倍)，37℃温育2h，然后加入TP4010ng/ml。阳性对照组加仅含TP40的培养液，阴性对照组加不含TP40及其他生长因子的培养液。温育24h，加入3H亮氨酸1.85×10⁴Bq/孔，37℃温育4h后倾去培养液，细胞收集及放射强度测定同上。

1.7统计学分析

各组间数据处理用t检验。

2结果

2.1肺腺癌细胞EGFR的表达

SPC-A-1细胞免疫组化显示出大量棕黄色的EGFR阳性染色，以细胞膜处最明显（图1）。

图1培养肺腺癌SPC－A－1细胞EGFR表达的

免疫组化染色（LSAB法，×400）

2.2TP40对肺腺癌细胞生长的影响

对照组SPC-A-1细胞生长的OD值为0.973±0.095;TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长的抑制作用不明显，OD值为0.965±0.080;浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，OD值为0.744±0.100;浓度为10及100ng/ml时，对SPC-A-1细胞生长具有很强的抑制作用，OD值分别为0.547±0.054和0.282±0.029。它们的变化趋势见(图2)，经统计分析（随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法），0.1ng/ml时的OD值与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的OD值与对照组有差异，且随着浓度增加OD值下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞生长的抑制呈剂量依赖。

图2不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞生长的OD值

＊P＜0.05＊＊P＜0.01

2.3TP40对肺腺癌细胞蛋白质合成的影响

对照组SPC-A-1细胞³H-亮氨酸掺入量为66.16±7.11Bq；TP40浓度为0.1ng/ml时，对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制作用不明显，³H-亮氨酸掺入量为65.13±7.23Bq；浓度为1ng/ml时，抑制作用明显，3H亮氨酸掺入量为51.59±5.06Bq；浓度为10ng/ml及100ng/ml时,对SPC-A-1细胞蛋白质合成具有很强的抑制作，³H-亮氨酸掺入量分别为22.33±3.27Bq及11.08±1.74Bq。IC₅₀为6.26ng/ml。它们的变化趋见(图3)，经统计分析（随机单位组设计资料的方差分析及SNK比较法），0.1ng/ml时的³H-亮氨酸掺入量与对照组无显著差异，而1ng/ml、10ng/ml及100ng/ml时的3H亮氨酸掺入量与对照组有差异，且随着浓度增加³H-亮氨酸掺入量下降有显著差异，说明TP40对SPC-A-1细胞蛋白质合成的抑制呈剂量依赖。

图3不同浓度TP40时肺腺癌SPC-A-1细胞³H-亮氨酸掺入量

＊P＜0.05＊＊P＜0.01

2.4EGF对TP40细胞毒性的竞争抑制作用

EGF竞争组³H-亮氨酸的掺入量（64.52±6.25Bq）显著高于aFGF竞争组（22.55±2.82Bq）及TP40组（22.13±3.17Bq），P＜0.01，接近未加TP40及其他生长因子的空白对照组（66.01±7.01Bq），ｐ＞0.05。说明EGF能竞争性地拮抗TP40对SPC-A-1细胞的毒性作用，提示:TP40的作用部位在细胞的EGFR。

3讨论