【摘要】目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。方法：分别采用脂质体、磷酸钙＋DMSO休克转染的方法，观察外源野生型p16基因短暂转染与长期稳定转染对人胶质瘤细胞系U251、SWO的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达，对转染后细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的变化进行分析。结果：p16基因短暂转染有明显的凋亡诱导作用；而p16基因长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用，但外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251、SWO细胞的生长，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了G₁期阻滞。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。

中图分类号：R730.5文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)02－0116－05

Different effects of p16 gene on human glioma cell lines through different transfection methods

CHEN Yi-zhaoXU Ru-xiangZHANG Shi-zhonget al

（Neurosurgery Department,Zhuj iang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510828,P.R.China）

【Abstract】 Objective:To determine the effect on the cell growth and apoptosis of CDK4I/p16 in human glioma cell lines.Methods:p16 gene was transfected into U251 and SWO cells by utilizing the methods of lipofectin or calcium phosphate co precipitation. Expression of exogenous p16 gene was confirmed by immunohistochemistry and Northern blot analysis. The effects of transient or stable expression of exogenous p16 gene on the growth of U251 and SWO cells were examined in vitro. Results:The transient expression of exogenous p16 gene induced apoptosis of the glioma cells,while the stable transfection of p16 gene did not. However, stable expression of exogenous p16 gene could inhibit cell growth dramatically and cloning efficiencies of the two cell lines were reduced as well. G₁ arrest of the tumor cells was observed. Conclusions: The expression of exogenous p16 gene could inhibit malignant growth of glioma cells and induce apoptosis.The reasons for the difference between the effects on apoptosis of transient and stable transfection of p16 gene might be the heterogenicity of the tumor cells and the “ selection” by the gene transfection.

Key Words：Glioma; p16 gene; Gene transfection

p16基因（MTS1,CDK4I,CDKN2）是近年发现的一个新的抑癌基因，是细胞周期调控基因家族中的重要成员，其主要作用机制是直接抑制细胞周期。在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，p16基因都有着高频率的缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达71％～82％^[1，2]，显示了它在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。因此研究p16基因对脑胶质瘤的作用，对于提高未来脑胶质瘤诊断治疗水平具有重要意义。然而，从p16基因发现到目前为止，p16基因与脑胶质瘤细胞凋亡间的关系却鲜有文献报道。本文通过短暂转染与长期稳定转染的不同方法分别将外源p16基因导入人胶质瘤细胞系U251、SWO，观察到p16基因短暂表达与长期稳定表达对胶质瘤细胞有不同的作用，并提出可能的遗传学机制。

1材料和方法

1.1细胞系

p16基因纯合性缺失的U251人胶质瘤细胞系、SWO人胶质瘤细胞系。U251细胞用含10％小牛血清的DMEM高糖培养基培养，为本实验室常规保存。SWO细胞系用含10％小牛血清的RPMI1640培养基培养，由张健博士惠赠。

1.2质粒

人PCDNA3－neo－p16由国立日本香川医科大学脑神经外科惠赠。空PCDNA3载体质粒由本实验室常规保存。

1.3抗体

鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。

1.4试剂

G418购自Amersham公司；DMEM、lipofectin为GIBCO BRL Life Technologies产品；MTT、PI购自Sigma公司。MTT溶于0.01MPBS中，终浓度5mg/ml，4℃避光保存。DMSO为Farco产品。

1.5细胞的短暂转染及长期稳定转染与筛选

细胞短暂转染采用磷酸钙＋DMSO休克的方法^[3]。常规等量磷酸钙－DNA转染后，加入含10％DMSO培养液孵育3分钟，提高转染效率。细胞的长期稳定转染采用脂质体lipofectin（GIBCO）的方法，将经分光光度计定量的等量质粒转染各细胞。500μg/mlG418筛选8周。以上均设立空PCDNA3质粒转染对照组。

1.6免疫组织化学

采用ABC法。

1.7Northern杂交分析

提取各转染筛选细胞系的总RNA。经分光光度计定量后，取20μg总RNA样品行甲醛变性的凝胶电泳，真空转膜，按BOEHRINGER MANNHEIM的程序进行探针DIG标记及Northern blotting。

1.8细胞生长曲线的测定

按郝新保的方法^[4]，采用MTT法绘制细胞生长曲线。

1.9流式细胞仪分析

按INicoletti的方法，常规消化各细胞系后，400目网过滤，200g离心后将细胞重悬于PI染液中（PI50μg/ml，0.1％柠檬酸钠，0.1％TritonX－100），避光4℃过夜后上机检测^[5]。

1.10细胞DNA片段化分析

收集经p16基因、PCDNA3空质粒磷酸钙－DMSO转染后48小时的细胞，用DNAzol（GIBCO）试剂提取基因组DNA。乙醇沉淀后，用20μlTE溶解DNA，1％琼脂糖电泳。

1.11统计学分析

曲线之间的比较采用方差分析。各细胞周期分布的比较采用t检验。n值为各组实验数。

2结果

2.1表达p16基因的胶质瘤细胞系U251、SWO的长期稳定转染和筛选

用lipofectin脂质体转染的方法分别将经分光光度计定量后的等量PCDNA3－p16及空质粒转入SWO及U251细胞系，经500μg／mlG418的筛选。加药约7天后，大部分细胞死亡。14天后，转染PCDNA3空质粒的SWO、U251细胞组开始出现克隆，26天后，p16基因转染的两细胞组才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空PCDNA3质粒转染组。筛选5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，经Northern-Blotting检测筛选高表达克隆。

2.2转染后外源p16基因的表达

p16基因免疫组化示经p16基因磷酸钙－DMSO转染的细胞系阳性细胞数明显增多（图1）。图2示经G418筛选的长期稳定转染p16基因的U251细胞免疫组化呈强阳性，对照组呈阴性或弱阳性。Northern blotting分析示U251－p16与SWO－p16细胞p16基因表达水平明显高于对照组（图3）。

图1磷酸钙－DMSO转染后P16基因的免疫组化（DAB显色,苏木素复染）

A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251细胞

图2U251细胞稳定转染筛选后的免疫组化（DAB显色，苏木素复染）

A.转染PCDNA3空质粒的U251对照细胞B.转染p16基因的U251－p16细胞

图3p16基因、PCDNA3空质粒转染后U251的

Northern blot分析

1:U251－p16;2:U251－p16；3:p16转染48h的U251;

4:U251－PCDNA3;5:U251

2.3p16基因磷酸钙－DMSO转染后对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用

U251、SWO细胞经p16基因短暂转染48小时后，光镜下可见部分细胞变圆，部分细胞脱落死亡；对照组细胞无明显变化。行流式细胞仪分析，可见p16基因转染48小时后出现明显的亚G₁峰（即凋亡峰）（图4）。提取该细