【摘要】目的:从正常人肝细胞系L02细胞中扩增人的肿瘤抑制基因p14^ARF，以研究其对人的多种肿瘤细胞生长的影响。方法:应用RT－PCR技术，从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出0.4Kb的p14^ARFcDNA片段，测序正确后插入真核表达载体pcDNA3上的BamHI和EcoRI位点，命名为pcDNA3ARF。此质粒由脂质体Lipofectamine^TM介导转染肿瘤细胞Hep2、KB、KB－v200、HepG2、HLE、Huh7以及MCF7和MCF7/ADR，经G418筛选2周后统计形成的集落数。结果:经抗生素G418筛选2周后，发现p53阳性的肿瘤细胞HepG2、Hep2、MCF7形成的集落数较少，分别为59±2.1,60±2.1和66±7.0，占各自对照组的47％，57％，58％；而p53异常的肿瘤细胞KB,HLE,Huh－7，则形成相对较多的集落，分别为91±2.5,48±2.0,41±2.0，占各自对照组的74％，65％，80％,但是二种p53异常的耐药肿瘤细胞株KB－v200和MCF7/ADR,形成的集落数最少，分别为13±2.0和21±1.5，占各自转染空载体pcDNA3的对照组的15％和17％。结论:p14^ARF能明显抑制p53阳性肿瘤细胞的生长，具有p53相关性;然而p14^ARF对p53阴性的耐药肿瘤细胞却具有强烈的抑制作用，由此提示:p14^ARF抑制耐药肿瘤细胞的生长是p53非依赖性的(至少在这两种耐药肿瘤细胞中)。

中图分类号：R735.5文献标识码：A

文章编号：1000-467X(2000)02-0104-04

Transfer of p14^ARF gene in human tumor cell lines inhibits cell proliferation

FAN Guo－chang

（Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850, P.R.China）

LEI Lei

（PLA General Hospital,Beijing 100853, P.R.China）

XIE Jian－jun

（Beijing Children Hospital,Beijing 100045, P.R.China）

【Abstract】 Objective: To clone p14^ARF gene from cells of the human normal liver cell line L02 and explore its inhibitory effect on tumor cell proliferation. Methods: p14^ARF cDNA was cloned from L02 cells by using RT－ PCR method and inserted into the BamHI and EcoRI sites of pcDNA3 (called pcDNA3ARF). Lipofectamine mediated pcDNA3ARF was transferred into tumor cell lines, such as Hep2, KB, KB－ v200, HepG2, HLE, Huh7, MCF7 and MCF7/ADR. The number of colonies of these tumor cell lines were calculated after more than two weeks' screening in DMEM medium containing G418. Results:The colony－forming efficiency of the p14ARF －transfected KB－v200 and MCF7/ADR drug－resistant cells was 13± 2.0 and 21± 1.5 , respectively, compared with 86± 3.1(15％ )and 126± 7.5(17％ )in the cells transfected with empty vector pcDNA3, and in the p53 positive tumor cell lines, such as HepG2(47％ ), Hep2(57％ ), MCF7(58％ ) cells, the inhibition was also found， whereas in the p53 negative tumor cell lines, such as KB(74％ ), HLE(65％ ), Huh－7(80％ ) cells, the inhibitory effect was milder. Conclusions: p14^ARF can suppress the growth of the p53 positive tumor cell lines in a p53－relevant manner, while in the p53 negative, drug－resistant tumor cells, p14^ARF has strong inhibitory effect, indicating the inhibitory effect of p14^ARF on growth of drug－resistant tumor cells is independent on p53, at least in KB－v200 and MCF7/ADR drug－resistant cells.

Key words：p14^ARF; Tumor growth suppress; p53; Drug－resistant tumor cells

细胞周期的调控是由许多不同基因组成的多条通路来完成的。在人类肿瘤细胞中，少数的几种基因经常发生突变，这些基因包括p53,RB,INK4α/ARF等。然而,正是它们构成的两条分子通路：RB通路（p16^INK4α－RB）和p53通路（ARF－p53）在调控人类肿瘤发生的过程中起着关键的作用，其中RB通路中的INK4α（p16^INK4α）和p53通路中的p53是经常发生改变的两个基因^[1,2]。RB通路发挥肿瘤抑制功能，是通过抑制细胞G₁－S期必须基因的转录，从而将细胞阻滞于G₁期；p53通路则产生两种情况：细胞凋亡和阻滞细胞于G₁期，这主要依赖于细胞类型和细胞状态。p53作为顺式作用因子和细胞内其它蛋白相互作用，最终产生肿瘤抑制功能。最近研究表明^[3]，这两条途径通过INK4α/ARF（9p21）位点而联系起来，该位点通过不同的阅读框架而编码两种不同的肿瘤抑制蛋白：p16和p14^ARF(鼠的同源物为p19^ARF)。关于p16^INK4α抑制肿瘤细胞增殖及其机制的研究，已有很多报道。而目前有关p14^ARF的认识大都来源于鼠的p19^ARF[4]。因此本文从正常人肝细胞系L02细胞中，RT－PCR扩增出0.4kb长的p14^ARF基因，以研究其对人的多种肿瘤细胞生长的影响。

1材料与方法

1.1细胞系

L02，人正常肝细胞系；Hep2，人喉鳞癌细胞系；KB，人鼻咽癌细胞系；KB－v200，鼻咽癌长春新碱耐药株；HepG2、HLE、Huh－7，人肝癌细胞系；MCF－7，人乳腺癌细胞系；MCF－7/ADR，乳腺癌阿霉素耐药株。上述细胞系除耐药细胞株外皆培养在37℃、5％CO2的条件,含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基（Gibco/BRL）中;KB－v200细胞的培养则需要在正常培养液中添加80nmol/ml长春新碱,MCF－7/ADR细胞的培养则需要添加8μg/ml阿霉素,实验前一周撤去药物。

1.2p14^ARF基因的克隆及真核表达载体的构建

1.2.1一般分子生物学操作方法:按常规方法^[5]进行，一些分子生物学工具酶均为Promega公司产品。引物的合成及序列测定由大连宝生物工程公司完成。

1.2.2RNA的提取及RT－PCR反应:胰酶消化生长状态良好的L02细胞，离心收集后用冷的PBS洗两次，再按RNA提取试剂盒操作步骤提取细胞总RNA。取总RNA1μg，加入Oligo(dT)引物1μg，在20μl体积、42℃作逆转录反应。取5μl逆转录产物为模板，进行PCR反应扩增。PCR反应条件如下：94℃，1min;50℃,1min;72℃,1.5min;5个循环。94℃，1min;60℃,1min;72℃,1.5min;35个循环。72℃延伸10min。AMV逆转录酶，Taq酶均为Promega公司产品。p14^ARF基因的引物如下：

上游引物：5'GGCGGA TCC ATG GTG CGC AGG TTC T-3'

下游引物：5'CCG AAT TCT CAG CCA GGT CCA CG-3'

1.2.3p14^ARFcDNA测序载体及真核表达载体的构建:上述RTPCR产物用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Promega公司)回收纯化，再用BamHI和EcoRI酶切，1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收此酶切的0.4kbp14ARF cDNA，克隆到质粒pSK的BamHI和EcoRI位点，命名为pSKARF。测序正确无误后，再将0.4kbp14^ARF cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3上的BamHI和EcoRI位点，命名为pcDNA3ARF。

1.3pcDNA3ARF转染肿瘤细胞

生长状态良好的肿瘤细胞，胰酶消化后铺于6孔板中，每孔3×10⁵细胞，生长至80％汇合后，按脂质体试剂LipofectamineTM(Gibco/BRL)转染步骤转染pcDNA3ARF和对照质粒pcDNA3。每孔加入1μg质粒和6μl脂质体，转染混合液加入到肿瘤细胞后，37℃，5％CO₂培养6h，再加入含20％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，胰酶消化，转入25cm²的培养瓶内，每瓶5×10⁵细胞，同时加入相应浓度的抗生素G418（Gibco/BRL)。Hep2、HepG2、MCF7和KB细胞，加入的抗生素浓度为800μg/ml,HLE和Huh7细胞为400μg/ml，KB－v200和MCF7/ADR细胞为300μg/ml。每隔3至4天换一次培养液，G418筛选2周（Huh7细胞生长较慢，需筛选3至4周）后，4％甲醛固定，结晶紫染色，统计形成的集落数。

2结果

2.1p14^ARFcDNA的扩增和鉴定

应用RT－PCR技术，从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增了0.4Kb的cDNA片段(图1)。BamHI和EcoRI酶切回收此片段，克隆到质粒pSK的BamHI和EcoRI位点上，命名为pSKARF，进行核苷酸序列测定分析，结果证实与文献^[6,7]报道的序列一致。

图1p14^ARFcDNA的RT－PCR扩增

1.DL2000 DNA Marker2.p14^ARFcDNA

GGC GGA TCC ATG GTG CGC AGG TTC TTG GTG ACC CTC CGG ATT CGG CGC GCG TGC GGC CCG

CCG CGA GTG AGG GTT TTC GTG GTT CAC ATC CCG CGG CTC ACG GGG GAG TGG GCA GCG CC