摘要：目的：探讨重组腺病毒介导人野生型p53，GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响，为临床使用该重组腺病毒治疗多药耐药的肿瘤提供实验基础。方法：选用p53异常的KB-s（VCR敏感）和KB-v200（VCR耐药）细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞，感染携带人野生型p53，GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒后，观察这两种转基因癌细胞的生物学行为（包括药物敏感性）的变化，结果：药物敏感和耐药细胞都对腺病毒易感，重组腺病毒携带的三个外源基因(p53、GM-CSF、B7-1基因)在两种细胞中都能得到有效表达，并且能抑制它们的生长及诱导其凋亡。耐药细胞KB-v200在转染该重组腺病毒48h后，其细胞膜上Pgp糖蛋白的泵出药物的功能却受到显著影响，表现为罗丹明123在其细胞内的积累增加。MTT的实验结果也显示出其对VCR药物敏感性的增加，裸鼠体内实验证实了感染上述重组腺病毒的KB-v200细胞的致瘤性降低，同时能增加对化疗药物VCR的敏感性。结论：实验研究结果提示，使用该重组腺病毒并结合化疗药物，对临床治疗多药耐药的肿瘤可能会更有效。

分类号：R735.5文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)01－0010－07

Effect of human wild-type p53， GM-CSF and B7-1 genes

on biological behavior of chemotherapy-resistant

tumor cells via recombinant adenovirus vector

FAN Guo-chang， WU Chu-tse＊ ， WANG Yan-fei， et al.

Department of Experimental Hematology， Beijing Institute of

Radiation Medicine， Beijing 100850， P.R.China

Abstract：Objective：To explore the effect on biological behavior of chemotherapy-resistant tumor cells by human wild-type p53， GM-CSF and B7-1 genes mediated via recombinant adenovirus.Methods： p53-abnormal KB-v200 (VCR resistant) and KB-s (VCR sensitive) cell lines were used as model tumor cells， which are resistant and sensitive to chemotherapeutic drugs， respectively. After infected with recombinant adenovirus carrying human wild-type p53， GM-CSF and B7-1 genes， changes in biological behavior (including drug sensitivity) of these two kinds of gene-transduced cancer cells were observed.Results： Both of the cell lines were susceptible to adenovirus， all of the three exogenous genes (p53， GM-CSF and B7-1) could be effectively expressed in these cell lines. Their growth was suppressed， and apoptosis was induced. The drug-pumping-out function of Pgp glycoprotein on the cytomembrane of drug-resistant KB-v200 cells was markedly affected 48h after transfection of the recombinant adenovirus， as revealed by increase of the amount of rhodamine 123 accumulation in the cells. The MTT assay also indicated the reversal of their sensitivity to VCR drugs. In vivo experiment in nude mice demonstrated reduction of tumorigenicity of the KB-v200 cells or KB-s cells infected with the recombinant adenovirus， and increase of their sensitivity to VCR. Conclusion： These study results suggest that clinical application of this recombinant adenovirus carrying multiple genes in combination with chemotherapeutic agents might be more effective in treatment of tumors with MDR.

Key words： Tumor gene therapy； Multidrug resistance； Adenoviral vector ▲

在肿瘤的临床化疗过程中，肿瘤细胞耐药性的产生常常导致化疗的失败。最初对化疗敏感的细胞，多次接受同一种化疗药物后，往往会获得对多种抗癌药物的抗性^[1]。目前已经阐明了一系列耐药机制，其中一种是与mdr1基因的表达产物——170kDa，Pgp（P-glycoprotein）糖蛋白上升有关^[2，3]。近年来研究表明，p53基因在多种抗癌药物诱导的凋亡过程中起着十分重要的作用^[4]。

腺病毒介导的基因治疗对于临床控制肿瘤的发生、发展和消退，提供了一种新的治疗手段^[5，6]。本实验室构建了携带人野生型p53基因和肿瘤免疫相关基因GM-CSF、B7-1的重组腺病毒(命名为BB-102)，并将其感染喉癌原代细胞，结果表明：腺病毒介导的人野生型p53基因能抑制喉癌细胞的增殖并诱导其凋亡；GM-CSF、B7-1基因可提高喉癌细胞的免疫原性，刺激自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）增殖，而且体外能诱导自体外周血淋巴细胞生成肿瘤杀伤性的CTL^[7]。显示出此重组腺病毒在肿瘤基因治疗中具有很好的应用前景。

本研究则选用p53异常的KB-s（VCR敏感）和KB-v200（VCR耐药）细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞，观察腺病毒载体对这两种细胞的转染效率，及重组腺病毒介导的人野生型p53，GM-CSF和B7-1基因在这两种细胞中的表达情况，并进一步检测KB-v200细胞转染此重组腺病毒后，药物敏感性以及在裸鼠体内的致瘤性的变化，为基因治疗的临床应用提供此方面的实验依据。

1材料与方法

1.1细胞系

整合了人5型腺病毒E1区的人胚胎肾细胞293细胞系由美国百特医疗用品公司基因治疗部（GeneTherapyUnit，BaxterHealthcareCompany，USA)惠赠，在含10％小牛血清的高糖DMEM，37℃，5％CO2条件下培养。

p53异常的人KB-s（VCR敏感）和KB-v200（VCR耐药）细胞系由中国医学科学院肿瘤研究所惠赠。其培养液为含10％小牛血清的RPMI-1640，在37℃，5％CO2条件下培养。

1.2重组腺病毒

携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（Ad-GFP），由美国百特医疗用品公司基因治疗部（GeneTherapyUnit，BaxterHealthcareCompany，USA)惠赠，；E1、E3区缺失的复制缺陷型Ad5重组腺病毒载体BB102含CMV启动子驱动的人野生型p53cDNA和人GM-CSFcDNA（两目的基因间由脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点，EMC-IRES相连），以及SV40启动子驱动的人B7-1cDNA，由本实验室邱兆华博士构建^[7]。

1.3重组腺病毒的扩增，纯化和滴度测定

按文献报告方法进行^[8]。

1.4重组腺病毒介导p53，B7-1和GM-CSF基因在药物敏感和耐药细胞中的表达

1.4.1腺病毒载体对药物敏感和耐药细胞的转染率：将人KB-s和KB-v200细胞种于6孔板，每孔为5×105细胞，12h后将培养液吸出，分别用0、12.5、25、50和100MOI的Ad-GFP（稀释于0.8ml培养液）感染细胞，1～2h后吸去病毒液，每孔加2ml培养液，12h后，在荧光显微镜下计数GFP表达阳性的细胞数，重复3次，计算转染率。

1.4.2免疫组织化学方法检测BB-102介导的人野生型p53基因的表达：KB-s和KB-v200细胞分别以5×104细胞／孔的量接种于12孔培养板，每孔底部加一小块盖玻片，使细胞能够自然生长于玻片上，24h后分别以50MOI的BB-102和Ad-GFP感染细胞，48h后将玻片取出，以丙酮固定细胞，通过anti-human p53 monoclonal antibody Pab240(PharMingen)免疫组化法检测p53在细胞中的表达。

1.4.3流式细胞分析检测BB-102介导的B7-1基因的表达：KB-s和KB-v200细胞以1×106细胞／皿的量分别接种于60mm平皿中，24h后以50MOI的BB-102感染细胞，48h后消化细胞，用Hanks液洗两遍，重悬于100×200μlHanks液中，加20μlFITC标记的鼠抗人B7-1单克隆抗体(PharMingen)，4℃孵育30min，用Hanks液洗两遍，重悬于1mlHanks液中，通过流式细胞分析检测BB-102介导的B7-1基因在两种细胞膜上的表达。

1.4.4ELISA检测BB-102介导的GM-CSF基因在两种细胞中的表达：KB-s和KB-v200细胞以5×105细胞／皿的量各自接种于60mm平皿中，24h后以50MOI的BB-102感染细胞，此后每24h收集上清，更换新鲜培养液，连续6天。GM-CSFELISAkit(Zymed)检测BB-102介导的GM-CSF在两种细胞中的表达。

1.4.5BB-102介导的外源基因对药物敏感和耐药细胞生长的抑制作用：两种细胞以1×104细胞／孔的量接种于24孔培养板，24h后以50MOI的BB-102或Ad-GFP感染细胞，此后每天观察细胞生长状况，随后将细胞消化下来，经台盼蓝染色后计数活细胞，并绘制细胞生长曲线。

1.5BB-102介导的外源基因对药物敏感和耐药细胞凋亡的诱导

采用末端转移标记检测DNA^[9]。两种细胞以5×10⁴细胞／孔的量接种于12孔培养板，每孔底部加一小块盖玻片，使细胞能够自然生长于玻片上，24h后分别以50MOI的BB-102或Ad-GFP分别感染细胞，72h后将玻片取出，以中性福尔马林固定细胞，通过3’末端标记法原位检测细胞凋亡（TdTFragEL^TM DNA Fragmentation Detection Kit，Oncogene）。

1.6多药耐药性检测

1.6.1MTT实验：按文献