【摘要】目的：探讨分化诱导剂维甲酸对肿瘤抑制基因--细胞间隙连接蛋白基因cx43在人子宫颈癌细胞系HeLa中表达的调节作用。方法：应用核酸原位杂交、流式细胞仪、Westen blot及Lucifer Yellow划痕标记荧光传输技术，研究维甲酸作用对HeLa细胞cx43 mRNA及其蛋白表达，以及对HeLa细胞生长和通讯功能的调节作用。结果：HeLa细胞经维甲酸处理后，原位杂交显示，HeLa细胞cx43 mRNA水平上调；流式细胞仪分析，Cx43蛋白荧光强度增强，阳性细胞计数率由1.9％上升至26.3％；Wester blot检测到分子量约43KDa的Cx43蛋白表达；HeLa细胞生长明显受抑；细胞间隙连接通讯功能有所恢复。结论：维甲酸可通过上调肿瘤抑制基因cx43及其蛋白在HeLa细胞中的表达，实现对宫颈癌细胞恶性表型的逆转作用，这可能是维甲酸肿瘤抑制作用的重要机制之一。

中图分类号：R730文献标识码：A文章编号：1000－467(1999)06－0646－03

The regulation effect of all-trans-retinoic acid on expression

of connexin gene cx43 in HeLa

CHEN Bi-liang,MA Xiang-dong,WANG De-tang,et al.

Department of Obstetric ＆ Gynecology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,P.R.China

【 Abstract】 Objectives：To investigate the expression of connexin gene (cx43)in human cervical carcinoma cell line HeLa,and the regulation effect of all-trans-retinoic acid (ATRA).Methods：In situ hybridization (ISH),flowcytometer (FCM),Western blot and Lucifer Yellow scrape loading and dye transfer (SLDT) were used to detect the expression of cx43 mRNA and protein in HeLa cell,and the regulation effect of ATRA.Results：After treatment with ATRA,HeLa cell grew much slowly than untreated cell.ISH showed cx43 mRNA detectable and up-regulation.FCM and Western blot found the positive rate of cx43 in 43KDa protein in HeLa cells increasing from 1.9％ to 26.3％.Gap junction intracellular communication (GJIC) recovered in RA-treated cell was more than untreated cell.Conclusion：The anti-tumor effect of ATRA on HeLa Cell might be due to up-regulation of cx43 gene and recovery of cx-mediated GJIC.

Key words：Connexin;Cervical neoplasm; Retinoic acid; In situ hybridization; Flowcytomeer;Gap junction intracellular communication

细胞间隙连接(gap junction)是相邻细胞间信息和能量交换的重要通讯方式，其基本结构即细胞膜上的间隙连接蛋白(connexin,cx)所构成的六聚体跨膜蛋白通道。cx基因被认为是非突变型肿瘤抑制基因。研究已表明，多种恶性肿瘤的发生及其恶性性状与间隙连接蛋白基因表达和间隙连接通讯功能(gap junction intracellular communication,GJIC)缺陷密切相关^〔2〕，这一现象又受到维甲酸等抗肿瘤药物的抑制。cx43基因表达缺失对子宫颈癌的发生有重要意义。维甲酸对宫颈癌的抗肿瘤作用是否与cx基因的参与有关尚不清楚，深入揭示维甲酸的作用机制有重要意义。

1材料与方法

1.1细胞培养及维甲酸(retinoicacid,RA)处理

人子宫颈癌细胞系HeLa培养于含10％热灭活小牛血清(美国GIBCOL)的RPMI-1640(美国GIBCOL)培养基中，于细胞对数生长期加入全反式RA(美国SIGMA)，终浓度分别为10^-2mol/L、10^-3mol/L、10^-4mol/L，间隔24小时按原浓度换液。每24小时进行细胞计数，绘制生长曲线。

1.2Cx43mRNA原位杂交

1.2.1探针制备：pSG5-cx43质粒(由湖南医科大学李桂源教授惠赠)经扩增、提取、纯化后，BamHI(美国GibcoBRL)酶切，7g/L琼脂糖凝胶电泳，以λDNA/HindⅢ＋EcoRⅠ为标准参照，DNA纯化回收试剂盒(美国Clontech)从胶中回收并纯化目的的基因片段，地高辛标记和检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim)标记探针，均按试剂盒说明操作。

1.2.2mRNA原位杂交：单层细胞爬片经0.2ml/LDEPC处理，0.2mol/LHCI酸化，5mg/L蛋白酶K37℃消化10分钟，0.1mol/L甘氨酸终止，40g/L多聚甲醛固定后充分干燥。滴加预杂交液，42℃孵育30分钟。将杂交液100℃变性10分钟，－20℃放置3分钟，滴加于细胞上，加硅化盖玻片，2×SSC湿盒内42℃杂交过夜。2×SSC、1×SSC、0.5×SSCBufferⅠ充分洗涤，100ml/L正常山羊血清封闭30分钟，加Dig-Ap复合物(1∶500)37℃孵育2小时。BufferⅠ洗涤，BufferⅢ平衡，NBT/BCIP避光充分显色，BufferⅣ终止反应，脱水、透明、封片。以胞质内出现蓝色颗粒为阳性。设阳性对照、阴性对照和空白对照。

1.3流式细胞仪分析

取RA处理的HeLa细胞及对照细胞制成单细胞悬液，加入鼠抗Cx43mAb(美国Zymed,1∶1000),4℃60分钟。离心收集细胞，用0.01mol/LPBS洗涤并悬浮，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(美国Jackson，1∶40)，4℃30分钟，PBS洗涤并悬浮后，于EPICS-PROFILEⅡ流式细胞仪(美国Coulter)488nm波长激发FITC，测定阳性荧光染色显示基因表达产物，Multicycle软件(美国Phonenix)处理结果，设无关鼠抗IgG代替一抗为特异性对照。

1.4Western blot

收集每组约1×10⁶细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰浴30分钟，提取细胞全蛋白。分光光度计测定蛋白浓度，每孔取40μg蛋白，与上样缓冲液混合，100℃煮沸变形4分钟，蛋白电泳装置(美国Bio-Rad)80V电泳30分钟至分离胶，120V电泳1小时，完成10％SDS-PAGE电泳。蛋白电转移(美国Bio-Rad)100V350mA1小时将蛋白转移至NC膜(美国Hybond)。1％人血白蛋白RT封闭2小时，加鼠抗cx43mAb(1∶1000)(美国Zymed)摇床孵育2小时，TBST洗涤10分钟3次，与辣根过氧化物酶标记IgGRT孵育1小时，TEST洗涤，增强化学发光检测试剂盒(enhanced chemoluminescence,ECL)(英国Amersham International plc)放射自显影于X光胶片上。

1.5LuciferYellow(LY)划痕标记荧光传输法

取经RA处理前后HeLa单层细胞爬片，锐刀划痕标记，10％LY标记细胞3分钟，无血清RPMI-1640洗净背景，以490nm波长激发后荧光显微镜上观察细胞间隙连接通讯状态。

2结果

2.1RA对HeLa细胞生长的影响

实验中发现，HeLa细胞经RA处理后，生长速度明显减慢，尤以10^-2mol/L对细胞的抑制作用最明显，其次是10^-3mol/L，最次是10^-4mol/L。在处理的第二天开始出现抑制作用，以后逐渐明显，RA对HeLa细胞的抑制作用呈现时间和剂量依赖性(图1)。

图1不同浓度维甲酸作用Hela生长状态的影响

2.2Cx43mRNA原位杂交

将提取、纯化的cx43cDNA探针进行地高辛标记后，对培养的HeLa细胞进行mRNA原位杂交，结果显示，常规培养状态下的HeLa细胞胞质中无明显cx43mRNA信号，原位杂交呈阴性(图2)。RA处理后的HeLa细胞胞质内出现cx43 mRNA蓝色阳性信号(图3)。

图2RA处理前HeLa细胞cx43mRNA阴性，ISH×400

图3RA处理后HeLa细胞cx43mRNA阳性，ISH×400

2.3流式细胞仪分析

HeLa细胞经RA作用后，Cx43蛋白表达增强，表现出明显的阳性荧光，HeLa细胞中Cx43蛋白表达阳性细胞计数率由RA作用前的1.9％上升至26.3％(图4)。

图4RA作用前后HeLa细胞Cx43阳性细胞计数率

a.RA作用前，阳性细胞计数率1.9％

b.RA作用后，阳性细胞计数率26.3％

2.4 Western blot

未经处理的常规培养HeLa细胞，经细胞蛋白提取、免疫杂交分析未发现明显的Cx43蛋白表达。HeLa细胞经RA作用后发现，分子量约为43KDa的Cx43蛋白表达明显增强(图5)。

图5Westernblot

a.Hela细胞经RA作用前

b.H