【摘要】目的：探讨全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导肿瘤细胞分化的分子机制。方法：采用Southern和Northern杂交方法对本室用ATRA诱导人肺腺癌细胞GLC-82，经消减杂交所构建的cDNA消减文库进一步鉴定；序列分析后用RT-PCR方法研究胎儿组织中的表达情况。结果：分离到一为ATRA激活表达的基因-PIGB1，该基因与人PG-B（phosphatidylinositol glycan of complementation class B）基因高度同源，在多种胎儿组织中均有表达。结论：PIGB1基因可能参与ATRA诱导肿瘤细胞分化过程。

中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)－06－063－04

PIGB1， a gene with highly homologous to PIG-B，up-regulated in human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 treated by all-trans retinoic acid

WANG Xue-jiao，WANG Xiu-qin，ZHANG Rui，et al.

Department of Cell Biology，National Lab of Molecular Oncology，Cancer Institute， Peking Union Medical College ＆ Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021，P.R.China

【 Abstract】Objective：To explore the molecular mechanism of cancer cell differentiation induced by all-trans retinoic acid (ATRA).Methods：Southern and Norhtern hybridization methods were used to screen the cDNA subtractive library constructed from ATRA induced human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 in our laboratory. After sequence analysis，RT-PCR method was used to analyze the expression pattern in human fetal tissues.Results：PIGB1，a gene highly homologous to phosphatidylinositol glycan of complementation class B (PIG-B)，up-regulated by ATRA，was cloned. PIGB1 expresses in various human fetal tissues.Conclusion：PIGB1 may be involved in differentiation of lung adenocarcinoma cell induced by ATRA.

Key words：All-trans retinoic acid； Lung adenocarcinoma；Differentiation；PIG-B； PIGB1

许多真核细胞膜蛋白通过与其锚定分子-糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）结合而锚定在膜上。GPI前体在内质网中的合成过程包括磷脂酰肌醇糖基化及随后的修饰过程。PIG-B是GPI合成过程中的一个关键酶，它催化第二个甘露糖的转运。通过进一步分析本室黎伯铨等采用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导人肺腺癌细胞GLC-82分化，运用cDNA文库消减杂交策略构建的ATRA诱导GLC-82细胞分化的cDNA消减文库^〔1〕，得到一为ATRA激活表达的基因，与PIG-B基因高度同源。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞及组织标本：人肺腺癌细胞系GLC-82，由昆明医学院梁明达教授惠赠，本室传代保存。胎儿组织，由北京垂杨柳医院妇产科提供。

1.1.2cDNA文库：未经ATRA诱导及经ATRA诱导1天和4天的人肺腺癌细胞GLC-82的cDNA文库：Lib.GLC-82，Lib.GLC-82.RA1与Lib.GLC-82.RA4及cDNA消减文库（由124个克隆组成），为本室黎伯铨等构建^〔1〕。

1.2方法

1.2.1ATRA诱导人肺腺癌GLC-82细胞分化：按文献^〔1〕所述方法进行。

1.2.2组织及细胞总RNA提取：按GIBCO公司TRzol试剂盒说明书进行。

1.2.3Southern杂交：Lib.GLC-82，Lib.GLC-82.RA1及Lib.GLC-82.RA4各10μg，经SalI及NotI酶切后于1％琼脂糖凝胶电泳分离，常规毛细管虹吸法转膜。cDNA消减文库中各克隆的插入片段回收后，按ECL^TM Random prime labelling and detection systems（Amersham）试剂盒说明书标记、杂交及检测。

1.2.4Northern印迹杂交：取30μg细胞总RNA，1.2％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳，常规毛细管虹吸法Northern转印。cDNA消减文库各克隆的插入片段按照Prime-a-Gene Labeling System（Promega）说明书以[α-³²p]-dCTP(＞3000 ci/mMol，10μci/μl，NEN)标记后作为探针，常规Northern杂交，放射自显影。

1.2.5逆转录PCR反应：以3μg胎儿组织总RNA为模板，以oligo(dT)12～18为引物，按照SuperScript^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(GIBCO/BRL)试剂盒说明书进行逆转录。以PIGB1内部特异引物5’-GCTGCTGCA-TAGGTACATGGT-3'及5'-GCTTGAAATTAGGAA-AGCGCT-3'进行PCR反应。20μl反应体积内含逆转录产物1μl，上下游引物各20pmol，0.4μl4×dNTPs(每种10mM)，2μl10×PCR缓冲液（含15mMMgCl₂）1UTaqDNA聚合酶，95℃预变性5分钟，94℃50秒，55℃50秒，72℃50秒，30个循环后72℃延伸5分钟。1.8％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2结果

2.1RA49的Southern杂交鉴定、测序及同源分析

Southern杂交结果显示（图1），cDNA消减文库中的一个克隆RA49仅在Lib.GLC-82.RA1中特异存在。对RA49进行全自动测序（图2）。RA49cDNA片段为768bp，同源比较结果显示，RA49的3'端约550bp与人PIG-BmRNA(phosphatidylinositol glycan of complementation class B)的3'端高度同源（98％），其中约330bp位于人PIG-B基因的编码区。因RA49与PIGB的高度同源性，将RA49命名为PIGB1。

图1RA49的Southern杂交结果

A：RA49的Southern杂交结果；B：cDNA文库SalI、NotI酶切后电泳结果（1％琼脂糖凝胶）；

c：Lib.GLC-82，1：Lib.GLC-82.RA1，4：Lib.GLC-82.RA4.

图2RA49的序列(加尾信号以下划线标出)

2.2RA49差异表达及mRNA大小确定

Northern杂交结果(图3)显示PIGB1存在两个转录本，分别为1.9kb与3.7kb，这两个转录本的表达均被ATRA升调节，这种改变从ATRA诱导6小时即出现，持续整个诱导过程。其中1.9kb的转录本与PIG-B的转录本大小一致，由两者之间的高度同源性推测1.9kb的转录本可能为PIG-B。

2.3PIGB1在组织中的表达采用RT-PCR方法分析PIGB1在胎儿组织中的表达情况(图4)，结果表明，PIGB1在胎儿皮肤、肝、心脏、食管、胃、脑、胰腺和肺中均表达，在心脏、食管、胃和肺中表达量较高。

图3PIGB1的Northern杂交结果

1：PIGB1的Northern杂交结果；2.细胞总RNA

1.2％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳结果；R、D分别

代表ATRA处理组细胞和DMSO对照组细胞；R

右下脚的数字代表处理的天数

图4RT-PCR方法分析PIGB1在胎儿组织中的表达情况

a：PIGB1；b：Tubulin；M：ΦX174/HaeIII；1：皮肤；

2：肝；3：心脏；4：食管；5：胃；6：脑；7：胰腺；8：肺

3讨论

通过分析ATRA诱导人肺腺癌GLC-82细胞分化过程中的基因表达差异，分离到一ATRA激活表达的基因-PIGB1。该基因3'端与人PIG-BmRNA的3'端约550个碱基高度同源，其5'端约200个碱基未发现同源序列。RT-PCR结果显示，PIGB1在多种胎儿组织中表达，提示PIGB1可能是一相对保守的基因，在细胞的基本生命活动中可能发挥重要作用。PIGB1已作为一个新的表达序列为GenBank所收录，编号为AF052498。

PIG-B是参与许多真核细胞（从酵母到哺乳动物）膜蛋白锚定分子糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）合成过程中的一个关键酶。PIG-BmRNA全长1.924kb，为日本Osaka大学TakahashiM.等人于1994年所发现^〔2〕。PIG-B基因位于人染色体15q21-q22，为编码554个氨基酸的内质网跨膜蛋白，氨基端约60个氨基酸位于胞浆侧，羧基端约470个氨基酸位于内质网腔内，是PIG-B的活性部位，RA49与PIG-B的同源区域大部分落在PIG-B的功能区，提示RA49很可能与PIG-B具有相同或相似的功能。在运用RA49作为探针与ATRA诱导前后GLC82总RNA进行Northern杂交时发现RA49有两个转录本，分别为3.7kb与1.9kb，其中1.9kb的转录本表达量高于3.7k