【摘要】目的：研究野生型和突变型p53基因cDNA转染对肝癌细胞系Hep3B的作用。方法：通过采用脂质体介导转染技术，将野生型、突变型p53的真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入一种p53和Rb基因缺失的肝癌细胞系Hep3B。结果：经G418筛选获得稳定的整合了野生型p53的克隆（wide-typep53,wt-p53）、突变型p53克隆（trans-doninant negativep53,TDN p53）和空载体克隆（pNeo）。经Northern和Western印迹鉴定，wt-p53、TDN P53细胞表达p53；wt-p53细胞的p21^waf1/cip1蛋白表达水平升高。wt-p53细胞生长较TDNP53、pNeo细胞缓慢，但不出现凋亡。采用0.2μg/ml阿霉素诱导这三组转染细胞，wt-p53细胞出现明显的凋亡。结论：转染野生型p53的Hep3B细胞的p53基因具有转录活性，与化疗药联合治疗Hep3B细胞引起明显的细胞凋亡。

中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1000-467X（1999）06-0652-05

Observations on the role of introduction of p53 genes into a hepatocellular carcinoma cell line Hep3B

HAN Yu-sheng,LIANG Li-jian,HUANG Jie-fu,et al

.Department of Hepatobiliary Surgery,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,P.R.China

【Abstract】 Objective：To study the role of introduction of wild-type and mutant-type p53 genes into a hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Hep3B.Methods：Hep3B cells lack of the expression of both p53 and retinoblastoma tumor suppressor genes because of deletions, were transfected with a wild-type (wt) p53 cDNA, a trans-dominant negative (TDN) p53 cDNA and control vector by a liposome method.Results：After G418 selection, stable wt-p53 transformants, TDN p53 transformants and control vector transformants (pNeo) were obtained. Northern and Western blot analysis detected the expression of p53 mRNA and protein in wt-p53 and TDN p53 transformants respectively. In wt-p53 transformants, induction of transcriptionally active p53 was confirmed by the increase of p21^waf1/cip1 protein. The growth rate of cells from wt-p53 was much slower than that from TDN p53 and pNeo transformants, while the cell growth curve of TDN p53 transformants was similar to that of pNeo transformants. The three kinds of transformants were treated with doxorubicin at 0.2 μ g/ml for 24 hours, and apparent apoptosis occurred in the wt-p53 transformants.Conclusion：The Hep3B cells transfected with wt-p53 genes possessimg transcriptionally active p53, were vulnerable to doxorubicin and cell apoptosis occurred when treated with doxorubicin.

Key words：Hepatocellular carcinoma; p53 gene; Transfection; Apoptosis

在恶性肿瘤中p53的突变是常见的，且在肝细胞癌中出现率高，约为50％^〔1〕。野生型的p53为肿瘤的抑制基因，而突变时则失去抑制细胞增殖的功能。野生型p53的作用是控制细胞增殖、生存和分化，其通过诱导细胞生长周期停止而作为细胞周期的负调节子，其重要作用是在细胞周期的G₁期。业已证明：在p53缺陷的恶性肿瘤细胞中，导入野生型p53可迅速诱导细胞凋亡^〔2〕。本实验研究了转染野生型、突变型p53基因对Hep3B细胞的治疗作用。Hep3B可提供并作为一种缺乏正常p53活性的肝癌细胞的实验模型；通过对p53基因诱导的p21^waf1/cip1这种下游靶子的转录的测定证明凋亡的可能途径；并采用常用的肝癌化疗药诱导p53转录活性。

1材料和方法

1.1细胞培养

Hep3B肝癌细胞系（来源于美国ATCC中心）用含有10％的小牛血清的RPMI-1640培养基培养，补充2mmol/LL-谷氨酰胺、青霉素(100Iu/ml)和链霉素(100μg/ml)；在供给5％CO₂、37°C的温箱中培养。该细胞系的p53基因和Rb基因均缺失，不能转录p53及Rb mRNA，不表达野生型p53及Rb蛋白^〔3〕。

1.2基因转染和转染克隆的筛选

编码人类野生型p53的真核表达质粒pC53-SN3和不含p53的空载体质粒pCMV-Neo-Bam由中山医科大学肿瘤防治中心曾益新教授惠赠。有三个突变点的人突变型p53（即TDNp53，该质粒的空载体也为pCMV-Neo-Bam）由美国St.Jude儿童研究医院的Gerard zambetti教授惠赠。根据使用说明，用转染制剂DOTAP(德国Boehringer Mannheim公司)转染培养的Hep3B细胞。灭菌的质粒和DOTAP分别用Hepes缓冲液稀释，然后混合在一起在室温内放置10～15分钟。用包含DOTAP/Pc53-SN3复合物、DOTAP/TDNp53复合物（质粒的最终浓度为1μg/ml）和DOTAP/空载体复合物的新的培养基代替已用过的培养基，培养6个小时；然后换用新的不含质粒的培养基继续培养；转染约24～48小时后，至细胞密度达50％～60％汇合，用含G418（初始浓度为200μg/ml，逐渐增至600μg/ml）的培养液筛选约14～21天，挑选单克隆继续用含G418（浓度为250μg/ml）的培养液培养，获得稳定的转染野生型p53质粒(wild-typep53，wt-p53)、转染TDNp53质粒(trans-dominant negativep53,TDNp53)和转染空载体质粒(control vector transtomants,pNeo)克隆，这三组转染细胞均稳定传代3个月以上。

1.3 Northern印迹分析转染细胞p53mRNA的表达

采用Trizol试剂（美国GIBCO公司）提取三组转染细胞的总RNA。各取15μgRNA,用1％的甲醛琼脂糖凝胶分离并转至尼龙膜。人类p53cDNA（武汉博士德公司）采用地高辛随机引物标记，Northern印迹杂交和检测根据德国Boehringer Mannheim公司生产的地高辛随机引物标记和检测试剂盒说明进行。

1.4 Western印迹分析转染细胞p53蛋白的表达

三组转染细胞裂解物蛋白的提取如文献所述^〔4〕。取等量的各裂解物标本在7.5％或12％的SDS-PAGE凝胶上进行分析。采用微量蛋白转移印迹分析仪(美国Bio-Rad公司)方法将分离的蛋白转至Zeta-Probe膜(美国Bio-Rad公司)上，然后进行Western印迹分析，采用BCIP/NBT显色检测^〔5〕。第一抗体是抗人p53单抗Do-7(美国Parmingen公司)和p21单抗sc-187(美国SantaCruz公司)，第二抗体为鼠抗人多克隆抗体（美国Parmingen公司）。

1.5三组转染细胞生物学行为的观察

一般形态学：在倒置相差显微镜（400倍）下观察。

细胞生长曲线：以1.0×104细胞/孔的浓度接种24孔板，常规条件培养，每天计数1次，每组计数3孔，每孔4次，取平均值，共计6天。

1.6阿霉素诱导三组转染细胞的凋亡

用75cm的细胞培养瓶分别培养wt-p53、TDNp53和pNeo细胞，待细胞生长至对数生长期时，用含阿霉素的培养液（浓度为0.2μg/ml）培养24小时，然后进行以下实验：

1.6.1DNA提取和电泳：收集培养的三组转染细胞（1×10⁷），用标准的酚/氯仿方法提取总基因组DNA，然后用2.0％琼脂糖凝胶电泳，30V电泳4小时，设标准DNA分子量。

1.6.2流式细胞术检测细胞周期：收集培养的三组转染细胞（1×10⁷），70％乙醇固定4℃过夜，碘化丙啶染色，Elite型流式细胞仪(美国Coulter公司)检测，观察是否存在凋亡细胞，计算出各期细胞百分比。

2结果

2.1 Northern印迹分析p53mRNA的表达

图1显示wt-p53、TDNp53细胞均有p53mRNA的表达（2、3），而pNeo细胞则无p53mRNA的表达(1)。

图1Northern印迹分析p53的表达

1：pNeo细胞；2：wt-p53细胞；3:TDN p53细胞

2.2 Western印迹分析p53、p21^waf1/cip1蛋白的表达

2显示：在wt-p53细胞中，1、3、4有p53蛋白的表达，2和5无p53蛋白的表达；图3显示：TDNP53细胞（2、3、4）均有P53蛋白的表达，而pNeo细胞（1）则无P53蛋白表达。图4显示：wt-p53细胞（3）的P21^waf1/cip1蛋白的表达量为TDNP53细胞的（2）2倍，为pNeo细胞的（1）8倍。

图2Western 印迹分析P53表达1～4：wt-p53细胞；5：pNeo细胞；M：标准分子量

图3Western 印迹分析p53表达2～4：TDNp53细胞；1