【摘要】目的：探讨人肝癌染色体DNA的丢失和增加的状态及其在肝癌临床病理及预后中的意义,并为寻找肝癌相关基因提供线索。方法：收集手术切除的肝癌标本31例，采用比较基因组杂交方法对肝癌染色体DNA拷贝数进行检测，同时进行病理观察和随访。结果：在染色体DNA拷贝数的增加中，以1q的频率最高（83.9％），其次为8q（61.3％）；在染色体DNA的拷贝数的减少中，以16q的频率最高（77.4％），其次为17p（61.3％）和4q（51.6％）。经统计分析发现，在1q拷贝数增加的病例中，其半年生存的相对机率比无1q扩增的病例高10.5倍（回归系数β=2.35，P＜0.05）；有17p丢失患者的半年内复发的相对危险性比无17p丢失的患者高6.86倍（回归系数β="1.93，"P＜0.05）。此外，1q的增加与肿瘤大小、有无包膜、坏死程度和AFP浓度等均呈负相关；4q和17p的丢失与肿瘤分化程度均呈负相关；4q的丢失与8q的增加呈负相关。这是第一次报道肝癌染色体DNA拷贝数的变化与肝癌临床、病理以及预后之间的关系。结论：在肝癌的发生发展中多个染色体的DNA拷贝数存在着高频率的变化，其中1q的增加提示肝癌的预后较好，而17p的丢失则提示肝癌的预后较差。

中图分类号：R735.7；R730.2文献标识码：A文章编号：1000-467X(1999)05-0509-05

The change of chromosome DNA copies is associate to clinic pathology and prognosis of hepatocellular carcinoma

WANG Hui-yun,GUAN Xin-yuan,FAN Yan,et al.

Cancer Institute, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510060, P. R. China

【Abstract】 Objective：To explore the change of copy number of chromosomal regions of hepatocellular carcinoma(HCC) and its relationship with the clinic pathology as well as the prognosis of HCC, providing the clue of cloning the key gene in HCC. Methods：Thirty-one HCC specimens obtained from surgical resection were used for detection of variation of chromosome DNA by comparative genomic hybridization. The samples also were examined pathologically and the data of follow-up were collected. Results： Among the gains of chromosome DNA copies, the highest frequency was 1q (83.9％ ), the second highest was 8q(61.3％ ); Among the losses of chromosome DNA copies, the highest frequence is 16q(77.4％ ), the followed were 17p(61.3％ ) and 4q(51.6％ ). Multiple Logistic Regression analysis showed that six month survive relative rate of patients with 1q gain was 10.5-fold higher than that of patients without 1q gain(β =2.35， P＜0.05)； the relative risk of six month recurrence of patients with 17p loss was 6.86-fold higher that of than patients without 17p loss(β="1.93，" P＜ 0.05). Correlation analysis show that the 1q gain was negatively correlative to tumor size, capsule, necrosis degree and AFP concentration. The losses of 4q and 17p were positively correlative to tumor differentiation degree. There was positive correlation between the 4q loss and 8q gain. The 4q loss was detected in most tumors originating from sixth-segment of liver and rare observed in tumors occurring in third-segment of liver. This study was the first analysis of the relationship between the change of copy number of chromosomal regions and the clinic-pathology as well as prognosis of HCC. Conclusions： The changes of copy number of chromosomal regions played important role during the development of HCC, and the 1q gain was a marker of good prognosis of HCC and 17p loss was a marker of poor prognosis of HCC.

Key words：Liver neoplasm；Chromosomes;human；Prognosis；Comparative Genome Hybridization

肿瘤的发生是一个多阶段、多遗传变异累积的过程，这一理论已被大家所公认。了解肿瘤的遗传变异对于阐明肿瘤的发生过程和癌变机理有重要作用。肿瘤细胞的遗传变异包括染色体和基因的异常。研究肿瘤细胞染色体异常的途径一是经典的细胞遗传学方法，另一途径是采用近十年迅速发展起来的分子生物学方法研究染色体上不同位点的变异。在这两类方法中，前者由于实体瘤的染色体制备困难、核型复杂不易分析而使其应用受限；后者由于仅能研究染色体少数位点的状态而难以了解染色体变异的全貌，因而使用上也受到一定的限制。1992年Kallioniemi等^[1〕报道了一种崭新的研究染色体拷贝数变化的分子细胞遗传学方法,称为比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)。该方法无需制备肿瘤染色体却可研究肿瘤细胞染色体拷贝数的变异情况(包括丢失和增加)，这对于肿瘤的遗传和分子生物学研究有重要意义。最近，我们用比较基因组杂交方法对我国的原发性肝癌进行了研究并结合临床及随访资料进行了分析，以探讨遗传变异与肝癌发生发展之间的关系，同时为寻找肝癌的相关基因提供线索。

1材料和方法

1.1病例

顺序收集本中心肿瘤医院1996年5月至8月初诊住院病人手术切除的肝癌标本31例，其中男27例、女4例，平均年龄49.5岁(范围26岁～71岁)。同时追踪观察和收集随访资料。

1.2病理检查

每个病例的肝癌标本经切片和HE染色后由高年资病理科医生观察记录各种病理变化。

1.3肿瘤组织DNA的抽提

切取的瘤组织立即置液氮保存，冻硬打碎后采用常规的酚-氯仿方法抽提基因组DNA。

1.4比较基因组杂交

基本上按Kallioniemi等^[1〕报道的方法进行，稍作改进，简述如下：

1.4.1探针制备：每个病例取1μg肝癌DNA和等量的正常人外周血单个核细胞DNA用缺口平移法分别标记fluorescein-12-dUTP和TexasRed-5-dUTP。

1.4.2原位杂交：常规方法制备正常男性外周血淋巴细胞分裂中期的染色体；取染色体分散良好的玻片用RNA酶（100μg/ml:2×SSC）37℃处理1小时，2×SSC洗两次，再入70％甲酰胺:2×SSC溶液中，于75℃变性5分钟，最后逐级脱水、风干。分别取标记好的肿瘤DNA和正常人血细胞DNA400ng一起加入10μl杂交液（50％甲酰胺:2×SSC:10％硫酸葡聚糖:5μgCot1DNA）,于75℃变性5分钟、37℃复性30分钟，然后将其加在已处理好的含染色体的玻片上，盖上盖玻片并予以封闭，于37℃杂交48小时。杂交后分别入0.4×SSC:0.3％Tween20于75℃漂洗2分钟共3次、2×SSC:0.1％Tween20于室温中洗3次，风干后用DAPI复染。

1.4.3数字图象分析：杂交后的玻片置于NikonSA表荧光显微镜下观察，显微镜配有CCD摄像头并连接到SUN工作站。每个杂交的染色体上显现的绿色荧光（肿瘤DNA）和红色荧光（正常细胞DNA）经工作站处理后给出两种荧光的比率及其分析图。当绿红荧光比率大于1.20时定为肿瘤染色体DNA拷贝数增加1个，若大于1.4则定为扩增；当绿红荧光比率少于0.80时定为肿瘤染色体DNA丢失1个拷贝。每个病例分析5个以上高质量的杂交核型，综合分析后得出每个染色体DNA变化的结果。

1.5统计分析

所有数据均经SPSS统计软件包整理和分析。采用列联表分析法统计处理各染色体拷贝数变化与临床资料、病理观察指标之间的关系；用多元Logistic回归分析统计处理各染色体拷贝数变化与随访资料（包括死亡和复发）之间的关系。

2结果

2.1肝癌染色体DNA拷贝数的变化

用CGH共检测了31例肝癌组织，全部病例均有染色体DNA拷贝数的增加，其中18例存在染色体DNA拷贝数的扩增；30个病例存在染色体DNA拷贝数的丢失；每个病例平均存在9.8（范围1～19）条染色体变异，其中每个病例平均存在4.4（范围0～10）条染色体DNA拷贝数的丢失、5.5（范围1～10）条染色体DNA拷贝数的增加（包括扩增）。以变异所涉及的具体染色体来看，24条染色体均有涉及，其中20条染色体既有DNA拷贝数的增加又有丢失，14号、16号和21号等3条染色体只有DNA拷贝数的丢失而无增加，7号染色体只有增加而无丢失。在高频率变异的染色体中，83.9％（26/31）的病例存在1qDNA拷贝数的增加，其中5例为扩增；61.3％（19/31）的病例存在8q的增加、35.5％(11/31)存在7q的增加；77.4％（24/31）的病例存在16qDNA拷贝数的丢失，61.3％（19/31）存在17p的丢失、51.6％（16/31）存在4q的丢失，具体详情见图1。

图1CGH检测31例肝癌DNA变异频率结果图.

染色体左侧的线条表示DNA丢失的范围;右侧的线条表示DNA增加的范围,粗线条表示扩增.

2.2染色体变异与<