【摘要】目的：探讨SV40早期基因编码产物大T抗原(Tag)表达及与抑癌蛋白pRb的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义。方法：采用免疫共沉淀及Western印迹法检测43例人脑肿瘤组织及5例正常人脑组织中Tag的表达，并对15例Tag阳性瘤组织检测Tag－pRb复合物的存在。结果：Tag在5例室管膜瘤及2例脉络丛乳头状瘤中全部表达，垂体腺瘤(5/6)、星形胶质细胞瘤(7/10)、脑膜瘤(4/6)、多形性胶质母细胞瘤(2/5)及髓母细胞瘤(1/5)均有Tag的表达；3例少枝胶质细胞瘤、1例松果体瘤及5例正常人脑组织无Tag表达。15例Tag阳性瘤组织中均发现Tag与pRb形成特异性复合物。结论：在人脑肿瘤组织中Tag广泛表达，Tag可与pRb形成特异性复合物，Tag－pRb特异性复合物的形成导致pRb失活，可能是人脑肿瘤发生发展的一个重要机理。

中图分类号：R739.41文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)04－0409－03

SV40 large tumor antigen forms a specific complex with pRb in human brain tumors

ZHEN Hai－ning, ZHANG Xiang, BU Xing－yao, et al.

Department of Neurosurgery,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,P.R.China

【Abstract】Objective：To research the role of SV40 early region gene coding product large tumor antigen (Tag) and the interaction between Tag and tumor suppressor pRb in human brain tumorigenesisMethods：Tag was investigated by immunoprecipitation and Western blot in 43 cases of human brain tumors and 5 cases of normal brain tissues.Tag－pRb specific complex was screened in 15 Tag positive cases.Results：Tag was found in all of 5 ependymomas and 2 choriod plexus papillomas, as well as in pituitary adenomas (5/6), astrocytomas (7/10),meningiomas (4/6),glioblastomas multiforme (2/5),medulloblastomas (1/5).None of the 5 normal brain tissues was positive for Tag,nor were 3 oligodendrogliomas and 1 pineocytoma. Tag－pRb complex was found in all of 15 Tag positive cases.Conclusions：SV40 Tag was expressed highly in human brain tumors,and can form a specific complex with pRb,the inactivation of pRb due to the formation of Tag－pRb complex may be an important mechanism in the etiopathogenesis of human brain tumors.

Key words：Brain tumor ;Simian virus 40(SV40);Large tumor antigen(Tag);Tumor suppressor;pRb

近年有关猿猴病毒40(Simianvirus40,SV40)与人脑肿瘤及其它某些类型肿瘤发生的病因学关系已成为肿瘤学研究的一个新热点^[1～3]。但对于SV40是否存在于人脑肿瘤组织中仍无统一认识。已知人体细胞是SV40的半容许性细胞，即使SV40确实存在于人脑肿瘤组织中，其是否具有致瘤性?以及机理如何?对此国内外均未见研究报道^[4，5]。我们采用免疫共沉淀及Western印迹法，检测了SV40早期基因编码产物Tag在人脑肿瘤组织中的表达，并发现Tag可与抑癌基因Rb产物pRb形成特异性复合物，这可能是SV40诱发人脑肿瘤发生的一个重要机理。

1材料与方法

1.1材料

本组43例人脑肿瘤新鲜标本取自手术切除瘤组织。按1990年WHO脑肿瘤分类标准经病理组织学检查确诊，包括星形胶质细胞瘤10例，脑膜瘤及垂体腺瘤各6例，多形性胶质母细胞瘤、室管膜瘤及髓母细胞瘤各5例，少枝胶质细胞瘤3例，脉络丛乳头状瘤2例，松果体瘤1例。5例正常人脑组织为脑外伤内减压术所得。组织标本离体后迅速置液氮中冷冻，此后储存于－70℃备用。

1.2主要试剂

小鼠抗SV40Tag单克隆抗体(Pab101)及兔抗人pRb多克隆抗体(C－15)均为SantaCruz公司产品；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗及ABC复合物皆为Sigma公司产品，A蛋白－sepharose珠为PharmaciaBiotech公司产品；复合蛋白酶抑制剂为宝灵曼公司产品；10KD梯度标准分子量蛋白质为LifeTechnologies公司产品；无关肝癌小鼠腹水由第四军区大学全军消化病研究所提供。

1.3免疫共沉淀

参照[文献6、7、8]进行，免疫沉淀物用1×SDS凝胶加样缓冲液溶解，100℃加热5min，离心后蛋白上清储于－20℃备用；阴性对照用无关肝癌小鼠腹水代替Tag单抗或pRb多抗。

1.4Western印迹

参照[文献6、7、8]进行，蛋白样品(5～20μl)经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。经1％BSA室温孵育1h，加入Tag单抗(1∶5000)或pRb多抗(1∶1000)4℃过夜，山羊抗小鼠二抗(1∶2000)或山羊抗兔二抗(1∶2000)以及ABC复合物(1∶10000)均于室温孵育1h，硫酸镍铵加强法DAB显色5～10min。

2结果

SV40Tag在5例室管膜瘤及2例脉络丛乳头状瘤中全部表达，6例垂体腺瘤中5例，10例星形胶质细胞瘤中7例，6例脑膜瘤中4例，5例多形性胶质母细胞瘤中2例，5例髓母细胞瘤中1例，均有Tag表达；而3例少枝胶质细胞瘤、1例松果体瘤及5例正常人脑组织无Tag表达(图1)。

图1免疫共沉淀及Western印迹法检测人脑肿瘤组织中Tag的表达，用小鼠抗SV40Tag单抗进行免疫共沉淀，Western印迹用小鼠抗SV40Tag单抗作一抗。(A)1：脉络丛乳头状瘤，2：室管膜瘤，3：星形胶质细胞瘤，4：多形性胶质母细胞瘤，5：髓母细胞瘤，6：星形胶质细胞瘤(与3同，阴性对照)。(B)1：垂体腺瘤(与2同，阴性对照)2－3：垂体腺瘤，4：星形胶质细胞瘤，5：多形性胶质母细胞瘤，6：脑膜瘤。

15例Tag阳性瘤组织，包括星形胶质细胞瘤3例，室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、脑膜瘤、多形性胶质母细胞瘤及髓母细胞瘤各2例，Western印迹均显示Tag及pRb蛋白带共同存在，表明Tag与pRb可形成特异性复合物(图1－3)。

图2免疫共沉淀及Western印迹法检测人脑肿瘤组织中Tag－pRb复合物的形成，用小鼠抗SV40Tag单抗进行免疫共沉淀，Western印迹用兔抗人pRb多抗作一抗。1：脑膜瘤(与2同，阴性对照，)，2：脑膜瘤，3：垂体腺瘤，4：星形胶质细胞瘤，5：多形性胶质母细胞瘤，6：室管膜瘤，7：脉络丛乳头状瘤，8：髓母细胞瘤。

图3免疫共沉淀及Western印迹法检测人脑肿瘤组织中Tag－pRb复合物的形成，用兔抗人pRb多抗进行免疫共沉淀，Western印迹用小鼠抗SV40Tag单抗(A)或兔抗人pRb多抗(B)作一抗。(A)1：室管膜瘤，2：脉络丛乳头状瘤，3：星形胶质细胞瘤，4：多形性胶质母细胞瘤，5：髓母细胞瘤，6：脑膜瘤，7：脑膜瘤(与5同，阴性对照)，8：垂体腺瘤。(B)1：室管膜瘤，2：脉络丛乳头状瘤，3：星形胶质细胞瘤，4：多形性胶质母细胞瘤，5：髓母细胞瘤，6：脑膜瘤，7：脑膜瘤(与6同，阴性对照)，8：垂体腺瘤。

3讨论

SV40是一种DNA肿瘤病毒，在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在仓鼠及转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成，但与人肿瘤发生的病因学关系始终未能明确[9]。本研究结果显示SV40早期基因编码产物Tag在人脑肿瘤组织中广泛表达，这不仅间接证明了SV40的存在，而且其早期基因具有转录和翻译的功能，提示SV40与人脑肿瘤发生密切相关。Tag在室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤中全部表达，提示SV40可能在这两种类型脑肿瘤发生中作用更为重要。3例少枝胶质细胞瘤和1例松果体瘤无Tag表达，这可能与检测标本数量较少有关，因此尚不能排除SV40在这两种脑肿瘤发生中的作用。Martini等^[3]采用PCR结合Southern印迹杂交检测83例人脑肿瘤组织，证实SV40早期基因在各型脑肿瘤中普遍存在，阳性率为14％～83％。本研究Tag表达水平较之早期基因存在水平为高，这可能与研究方法不同有关，也可能缘于我国人群中SV40感染率较高。

体外研究表明Tag具有多种致癌活性，包括与抑癌蛋白pRb、p53、p107、p130等形成特异性复合物，使其抑癌活性丧失；整合至细胞基因组破坏其正常结构及稳定性；反式激活细胞基因异常表达等^[6，7，9]。Tag在人脑肿瘤中的表达使我们想进一步了解Tag是否仍具有类似于体外的某些生物活性以及在人脑肿瘤发生发展中具有何种意义。本研究结果显示在Tag阳性瘤组织中，不论用Tag单抗还是是用pRb多抗进行免疫共沉淀，Western印迹均显示Tag(94KD)及pRb(110KD)蛋白带共同<