【摘要】目的：通过以p21作为标志物的功能检测方法了解慢性粒细胞白血病中p53基因功能状况。方法：采用western blot方法检测未经阿霉素诱导及阿霉素诱导后慢粒患者白血病细胞中p53及p21蛋白表达。结果：对25例慢粒患者白血病细胞进行了检测，显示5例p53基因功能异常，其中1例为慢性期，显示p53基因为野生型，但无功能；1例为加速期；3例急变期，分别为急粒变、急单变和多克隆急变，在急淋变中未见。p53基因功能异常者预后差。结论：p53基因功能异常多出现于慢粒急性髓细胞变，与患者预后相关。除因基因本身改变而致p53功能丧失外，慢粒中可能存在p53抑制因子或结合蛋白，致使p53功能丧失。

中图分类号：R733.72文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)04－0404－03

Functional detection of the p53 gene in chronic myeloid leukemia

BI Dan¹, ZHOU Shu－yun¹, ZENG Mu－sheng², et al.

1.Hematology Department, Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515, P.R. China

2.Cancer Center,Sun Yat－sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,P.R.China

【Abstract】Objective：To assess endogenous p53 status in Chronic myeloid leukemia (CML),we established a functional assay by use of p21 as a marker.Methods：Western blot was used to detect p53 and p21 protein expression of the CML cells treated with or without the chemotherapeutic drug adriamycin.Results：Samples from 25 CML patients were assessed.We identified p53 gene functional abnormalities in 5 cases,1case in chronic phase,which showed p53 gene was wild type,but was non－functional;1 case in accelerated phase;3 cases in blast crisis,including 2 myeloid blast crisis and 1 mixed blast crisis. No p53 functional abnormalities was found in lymphoid blast crisis.Patients with p53 functional abnormalities had poor prognosis.Conclusions：The results present further evidence that p53 gene functional abnormalities are involved in the pathogenesis of the myeloid progression of CML and are closely related with the prognosis of the disease.There may be p53 suppressor factors or combination proteins which lead to functional inactivation of the p53 gene and it might be one of the mechanisms underlying disease progression of CML.

Key words：p53;p21;Gene; Chronic myeloid leukemia

p53基因是重要的肿瘤抑制基因，wtp53基因具有控制细胞周期限制点，调节基因转录，诱导细胞凋亡等多种功能。在慢性粒细胞白血病(CML)中，p53基因异常大多出现于疾病进展期，与CML急变、疗效及预后密切相关。因此，我们根据p53对p21的调控机理，以p21做为标志物，应用蛋白印迹杂交技术直接检测CML中p53蛋白功能，探讨p53基因功能状况在CML慢性期及急变中的作用及其临床意义。

1材料与方法

1.1标本来源

25例CML病人，男性17例，女性8例，其中慢性期14例，加速期4例，急变期7例。所有患者均经FAB分型、单克隆抗体免疫分型、bcr/ablmRNAPCR检测等确诊。急性期患者外周血或骨髓中的白血病细胞数均在50％以上。

鼻咽癌细胞株Fadu做阳性对照，HL－60细胞株做阴性对照。正常人外周血标本做正常对照。

1.2方法

1.2.1取材：抽取肝素抗凝的外周血或骨髓，使白细胞含量慢性期在5×10⁷以上，急变期在1×10⁸以上。用等体积RPIM1640稀释，置淋巴细胞分离液上，1800rpm离心20分钟，收集界面的单个核细胞。RPIM1640洗涤两次，含10％小牛血清的1640重悬细胞，将细胞按1～2.5×10⁵/ml密度等量分于两个培养瓶中。

Fadu，HL－60细胞从液氮冻存中复苏后，置含10％小牛血清的1640培养基中37℃、5％CO2培养4天后收集细胞，将细胞等量分于两个培养瓶中，每瓶细胞数约1×107。

1.2.2培养：参照文献^[1]进行。将两个培养瓶中的一瓶按0.2μg/ml加入阿霉素，称阿霉素组，另一瓶不加，为对照组，培养18小时。

1.2.3蛋白质提取及定量：分别吸出培养瓶中细胞，PBS洗2次，离心弃上清，打散，加入等体积上样缓冲液，煮沸10分钟，－20℃冰箱保存备用。甲醇浸湿硝酸纤维素膜，蒸馏水冲洗，滤纸吸去多余水分。点加0.2μg/ml，1μg/ml，5μg/ml及10μg/ml标准蛋白液各1μl及点加待测样品各1μl于上述硝酸纤维素膜，室温干燥。胺基黑染膜1分钟，脱色液浸洗两次，待完全显色后与标准对比，判断样品蛋白含量。

1.2.4蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳：每泳道加样量约为100μg，每个患者样本均按对照组、阿霉素组的次序加入两个泳道，剩余泳道用上样缓冲液平衡。电泳时间4小时。

1.2.5转膜：常规方法将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶电转移至硝酸纤维素膜上，时间2小时。

1.2.6染色、脱色及封闭：参照SIGMA公司胺基黑染液说明书进行。转膜后将膜取下，胺基黑染膜1分钟，脱色液浸洗两次，每次10分钟，待完全显色后用铅笔标记蛋白分子量的位置，在p53与p21之间将膜剪开。将剪开的膜用TBS液冲冼后用5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

1.2.7抗体标记：p53单抗(Do－7,鼠抗人IgG2b)为DenmarkDAKOA/S公司产品，可与野生型及突变型p53反应，识别位点在多肽链的N－端。p21单抗(Anti－WAF1,Ab－1)为CALBIOCHEM公司产品。一抗p53(1∶200)，p21(1∶200)分别与对应的膜装入塑料袋中，赶气泡后37℃脱色摇床孵育2小时，定时翻动。TBS洗涤缓冲液洗膜2～3次，每次10分钟。二抗(辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG,1∶5000)与膜孵育2小时，TBS洗涤缓冲液洗2～3次，每次10分钟。

1.2.8ECL显影：参照ECL试剂盒说明书进行。

2结果

2.1p53基因功能检测结果判定方法^[1]

①p53基因功能正常：对照组p53无表达或表达很低，p21有表达。阿霉素组p53及p21表达均较对照组增加；②p53基因突变致功能异常(突变型p53半衰期长)：对照组及阿霉素组p53均有高表达且两者间无差异。p21无表达或表达量很低且阿霉素组p21表达较对照组无增加；③可能因存在p53抑制因子或结合蛋白致其功能异常(p53本身为野生型)：阿霉素组p53表达较对照组明显增加，阿霉素组p21表达与对照组比较无变化；④存在不依赖p53的p21途径：阿霉素组比对照组p53表达无增加，而阿霉素组比对照组p21表达明显增加。

2.2结果判定

2.2.1正常人外周血标本：与结果①相符。

2.2.2细胞株：Fadu与结果②相符。HL－60对照组及阿霉素组均未见p53及p21蛋白表达。(图1)

图1WesternBlot显示CML细胞中p53及其对应p21表达。

条带上数字为病例号，其后有A者代表阿霉素组，无A者代表对照组，F代表Fadu细胞株(阳性对照)，H代表HL－60细胞株(阴性对照)，M为标记的分子量(图2～4均相同表示)。可见第3、4例与Fadu类似，对照组及阿霉素组p53均为强表达而p21无表达或表达很低且两组间无差别，提示p53功能异常。HL－60对照组与阿霉素组p53及p21均无表达。

2.2.3CML病例：25例CML中，p53表达受阿霉素诱导的有21例，不受阿霉素影响的有4例，1例为加速期病人，3例为急变期病人。

根据上述判断方法，25例CML中，与结果①相符的有20例，与结果②相符的有4例，与结果③相符的有1例(图1～4)。

图2第11、13两例对照组p53为低表达，诱导后p53及p21均明显增加，说明p53功能正常。第14例对照组及阿霉素组p53均为极强表达而p21无表达，提示p53功能异常。

图3Ⅰ为正常人标本(正常对照)，p53为低表达，诱导后p53及p21表达均增加，说明p53功能正常。第1、5、7例与Ⅰ类似。第6例阿霉素组比对照组p53表达明显增加但无相应的p21增加，其功能依然异常。

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