【摘要】目的：克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。方法：采用mRNA差异显示技术识别原代大鼠气管上皮细胞同由α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的差别表达基因。结果：共克隆到15个可能同α粒子辐射致细胞恶性转化相关的差异表达基因片段(ESTs)，共向GenBank登录7条新基因序列。其中克隆ZC66同肿瘤转移抑制基因nm23高度同源，经Northerm杂交证实其在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达，序列分析提示nm23在此恶转细胞中存在突变。结论：上述结果为进一步深入研究辐射致癌提供了线索，并提示nm23基因可能参与α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化的原发过程。

中图分类号：R73－354文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)04－0392－03

Nm23 was involved in the neoplastic transformation of rat tracheal epithelial cell induced by α particles radiation

LI Gang, WU De－chang, HU Ying－chun,et al.

Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,P.R.China

【Abstract】Objective：To isolate genes involved in neophastic transformation induced by α －particles.Method：The differential display technique was used to identify differentially expressed RNA species between primary and neoplastic transformed rat tracheal epithelial (RTE)cells.Results：Fifteen differentially displayed gene fragments were cloned and sequenced.Seven novel gene sequences were submitted to GenBank.Homology searching revealed that clone ZC66 is highly homologous to rat NDPK gene or metastasis suppressor gene nm23, Northern hybridization confirmed its up－regulation in the transformed RTE cells,sequence analysis suggests that nm23 may be mutated in the transformed RTE cells.Conclusion：These results provide clues to elucidate the mechanisms of radiation oncogenesis and suggest that nm23 may be involved in the neoplastic trancformation induced by α－particles radiation.

Key words：Aplpha particles;Rats;Cell transformation, Neoplatstic;Polymerase chain reaction;Genes nm23;Tra chea;Cytology;Epithelial cells;Radiation effects

正常本底地区人均受照平均有效剂量的54％来源于氡及子体α粒子辐射，根据矿工肺癌的流行病学资料，估计肺癌发生的10％～20％可归因于氡及子体的α粒子辐射^[1]，因此本实验室十多年来重点研究α粒子辐射致癌的特点与机制。研究α粒子辐射致癌的机制不能局限于观察已知癌基因、抑癌基因的在各种模型中的表达及突变状况，而需全面识别正常细胞同相应恶转细胞之间的差别表达基因，寻找未知的参与辐射致癌的基因。基于此目的，本项研究在本实验室已成功建立的由α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞株的基础上，采用mRNA差异显示技术比较该转化细胞同相应的原代细胞在基因表达方面的差异，克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。

1材料与方法

1.1细胞模型

按Gray等的方法分离、培养原代大鼠气管上皮细胞^[2]。经239Pu/α粒子放射源射后照射后恶转的RTE细胞系是由赵永良博士建立的，具有裸鼠致瘤性^[3]，在含5％的小牛血清，5μ/ml的胰岛素，0.3μM的氢化可的松的F12培养基中培养。

1.2差异显示

差显引物购自GenHunter公司。采用Trizol试剂(Gibicol公司)提取总RNA。差异显示按梁鹏等报道的方法^[4]，略加改进，简述如下：mRNA的反转录：反应总体积50μl，其中5xRTbuffer10μl,dNTP(250μM)4μl,DTT(0.1M)5μl，总RNA(2μg/μl)2μl，锚定引物H－T11M(M可为A、C或G，2μM)10μl,dH2O15μl，混匀、65℃5分钟、37℃10分钟，然后加入MMLV反转录酶4μl，(200U/μl)，37℃反应60分钟，75℃5分钟终止反应。PCR反应：dH2O8.7μl,10xPCR缓冲液2μl，MgCl₂(25mM)1.2μl，dNTP(25μM)1.6μl,随机引物(H－AP_1－8，2μM)2μl，锚定引物H－T11M(2μM)2μl，反转录产物2μl，α－^[32P]dCTP(10μCi/μl)0.3μl，AmpliTaq(5U/μl)0.2μl,PCR反应条件：94℃30秒、40℃2分钟、72℃30秒，40个循环，72℃延长5分钟。6％的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，－80℃X光胶片暴光12～24小时。

1.3差异片段的回收、重扩增及克隆

切下差异表达条带，煮沸法、醋酸钠/乙醇沉淀回收聚丙烯凝胶中的DNA。PCR重扩增体系50μl，除dNTP浓度增至250μM和不加同位素外，其它条件同前。使用TA载体系统(PCRTM2.1载体，Invitrogen公司)克隆重扩增产物。

1.4Northern杂交

按文献报道的方法^[5]进行Northern杂交，探针的标记方法为随机引物法(Prime－a－gene Labeling System, Promega)。

1.5序列的测定及其同源性检索

PE/Model373A型DNA序列自动分析仪测定克隆序列。采用美国国产生物信息中心(NCBI)的BLAST软件作为序列同源性的检索工具，其网址为：http：//www.nlm.nih.gov,对比数据库主要为NR库(包括GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB收录的所有非冗余序列)和ESTs库，检索程序主要采用BLASTN。

2结果

2.1mRNA差异显示

本实验共采用24种引物组合进行mRNA差异显示，观察到约80个差异条带。根据①反向Northern杂交已证实；②长度一般大于300bp；③在差显图谱上有明确差别等原则选择差异条带进行克隆，共克隆到15个差异表达片段。

2.2Northern杂交

32P标记克隆ZC66、ZG63的酶切回收片段作为探针，进行Northern杂交。因原代细胞的RNA难以获得，为节省起见，本实验为两种探针依次与同一张转印膜杂交，结果见图1。根据Northern杂交的结果可见克隆ZC66、ZG63在已恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达(相对于原代细胞)。

图1Northern杂交证实ZC66，ZG63在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达

P：原代细胞；N：恶转细胞

2.3克隆ZC66为肿瘤转移抑制基因nm23

测得克隆序列后，检索GenBank数据库，对序列进行同源性分析，结果发现：其中的7条序列同已知基因无明显同源性，作为新基因序列被登录到GenBank，登录号分别为：AF0078383，AF007837，AF011366，AF011363，AF011364，AF011365，AF011367。克隆ZC66同大鼠的核苷二磷酸激酶(RatNDPK21)基因高度同源(一致性98％，E值=e－44)，尤其是在第47位碱基以后同该基因100％同源(图2)，NDPK基因即肿瘤转移抑制基因nm23。克隆ZG63(图3)不同任何已知开放阅读框的基因同源，作为新序列被登录到GenBank(登录号为AF007837)。

图2克隆ZC66同RatNDPK21基因高度同源

图3克隆ZG63的序列，划线部分为引物序列

3讨论

全面识别正常细胞同相应肿瘤细胞/恶性转化细胞之间的差别表达基因、寻找未知的参与致癌过程的基因，日益成为目前肿瘤机制研究的关键步。本研究采用mRNA差异显示技术，比较正常的原代大鼠气管上皮细胞同由α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间在基因表达方面的差异。目前共克隆到15个差异表达基因片段，其中克隆ZG63为新基因序列，Northern杂交证实其在恶转的个RTE细胞中高表达，目前克隆其全长基因的工作正在进行当中。克隆ZC66经同源性检索同大鼠的核苷二磷酸激酶基因(NDPK)高度同源，NDPK基因即瘤转移抑制基因nm23。

nm23是由Steeg等^[6]采用差别克隆杂交技术克隆到的同肿瘤转移相关的基因，其表达下调同肿瘤的高恶性转移能力明显相关，并在各种体内体模型中得到证实^[7]。高转移的小鼠黑素瘤、人乳腺癌细胞系在转染了相应nm23cDNA后，其转移能力受到50％～90％的抑制。自nm23发现10多年来，研究者的兴趣大都集中于研究nm23在具有不同转移能力的肿瘤组织之间的差异表达状况，及其抑制肿瘤转移的机制，而对nm23基因在肿瘤组织与相应的正常组织之间是否存在表达差异重视不够。本实验通过差异显示发现并经Northern杂交证实：nm23基因在α粒子诱发恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达(同原代细胞相比)。Gazzeri等也观察到类似的nm23蛋白在多种组