【摘要】目的：探讨BCR介导B淋巴细胞凋亡的作用机制。方法：光镜观察细胞形态。³H-TdR掺入法检测细胞生长。应用FACS：(1)Annexin V法检测细胞凋亡，(2)PI染色分析细胞周期。结果：IgM影响Daud细胞的生长，改变细胞形态，镜下可见类似细胞凋亡样变化。高浓度IgM明显抑制其生长。Annexin V分析显示IgM刺激可导致Daudi细胞发生凋亡；凋亡的发生存在时间上的规律性，在IgM刺激后的48～72小时，细胞凋亡最多；极高浓度IgM导致细胞迅速凋亡。DNA含量分析显示，凋亡发生在G₁期和S期两群细胞比值相差最大时。结论：IgM可诱导Daudi细胞凋亡，细胞不能通过G₁→S的检测点很可能是细胞凋亡发生的重要原因之一。

中图号：R733文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)02－0121－05

Apoptosis induced by IgM in human B lymphoma Daudi cell line

ZHANG Fan ZHU Hong xia QUAN Lan ping et al

Laboratory of Cellular and Molecular Biology,Cancer Institute,Chinese Academy of

Medical Sciences,Beijing 100021,China

【Abstract】Purpose:To investigate the mechanism of apoptosis in human B lymphoma Daudi cell line mediated by B cell antigen receptor(BCR).Method:Observing the cell morphology change by microscope .Cell growth were analyzed by ³H-TdR incorporation.Using fluorescence activated cell sorter (FACS)for:(1)detecting cell apoptosis with Annexin V;(2)analyzing cell cycle by propidium iodide (PI)staining.Pesult:IgM induced Daudi cell growth arrest and morphology change. At high concentration,IgM significantly inhibited cell growth.Annexin V analysis demonstrated that cell apoptosis was triggered by IgM and most of the cells went to apotosis during 48～ 72h after stimulation by IgM.At ultimate high concentration, IgM triggered cell apoptosis more quickly. DNA content analysis showed that cell apoptosis occurred when the ratio of G₁ and S phase cclls reached to maximum.Conclusion:IgM can induce Daudi cell apoptosis and this may be resulted from a failure to progress through a G₁→S checkpoint(s).

Key words:Apoptosis;Human B lymphoma;Cell cycle

自70年代以来，人们就认识到细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果^[1]。细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻遏肿瘤迅速生长。人们在肿瘤治疗的长期实践中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，以达到治疗肿瘤的目的。而且，能否诱导肿瘤细胞的凋亡很可能是决定化疗效果的重要因素之一。

B淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分。B淋巴细胞发育时需经过正负选择，正相选择结果是B淋巴细胞活化，为机体提供参与免疫应答的正常B淋巴细胞。负相选择则导致B淋巴细胞凋亡，是免疫应答时驱除自身反应性B细胞的基本机制。抗原刺激B细胞的活化，依赖于抗原与其表面的抗原受体复合物(Bcell antigen receptor，BCR)的结合^[2]。BCR介导B淋巴细胞凋亡是近年免疫学研究的热点。虽然对其进行了大量研究^[3-6]，但发生机制仍未完全明了。本研究应用人B淋巴瘤Daudi细胞，观察BCR介导Daudi细胞生物学行为的改变，探讨其发生机制，以期很好地认识B淋巴细胞恶性肿瘤发生、发展的分子机制以及探讨可能的治疗肿瘤的新途径。

1材料与方法

1.1试剂

兔抗人IgM抗体购自DAKO公司(Code No.A0426)。³H-TdR购自杜邦公司。Annexin V试剂盒为Genzyme公司产品。碘化丙啶(PI)购自华美生物制品公司。

1.2细胞系及培养

Daudi细胞是人B细胞淋巴瘤细胞株(从ATCC引入)，20％胎牛血清的RPMI1640，5％CO₂37℃孵箱中培养。

1.3 ³H-TdR掺入法

接种约1×106/ml细胞于96孔板中，分别用血清浓度为0和10％的RPMI1640培养，并加入终浓度为0～200μg/ml的IgM抗体，分别刺激48小时和72小时。于终止培养前12小时，加入³H-TdR，收集细胞，液体闪烁仪检测CPM。

1.4Annexin V法

接种约1×10⁶/ml细胞于24孔板中，血清浓度为10％的RPMI1640培养，并加入IgM抗体，分别于指定时间800～1000转/分，室温离心5～10分钟，收集细胞，取1/2细胞用于本方法(另1/2细胞用于下述1.5PI染色分析)。冷PBS洗涤细胞一次，将细胞重悬于100μml Annexin V孵育缓冲液中(10×Binding buffer 10μl＋PI 10μl＋Annexin V conjugate 1μl＋79μl去离子水)，于暗室中孵育15分钟。再加入400μl结合缓冲液(10×Binding buffer40μl＋360μl去离子水)。一小时内用FACS测试，用FL1/FL2软件分析结果。

1.5PI染色法分析细胞凋亡和细胞周期

1.4项中处理的1/2细胞，收集于离心管中，800～1000转/分离心5分钟，共两次。冷PBS洗涤细胞一次，加入200μlRNaseA(1mg/ml)，37℃水浴30分钟。再加入800μlPI染色液(PI100μg/ml，Triton-x 1001.0％,NaCl0.9％)，混匀，至4℃避光30分钟。FACS检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。结果用细胞周期拟合软件进行分析。

2.结果

2.1IgM对Daudi细胞形态改变和生长的作用

人B淋巴瘤细胞系Daudi细胞能否对IgM刺激有所应答，首先取决于膜表面IgM受体的存在状况。间接免疫荧光标记后，FACS结果表明，95％以上的Daudi细胞表面存在大量IgM受体。所以，本研究应用该细胞系，观察BCR介导B淋巴瘤细胞生物学的反应，探讨其发生的机制。大量研究发现正常成熟的B淋巴细胞经抗原受体介导，极低浓度的IgM(1μg/ml)即可引起B细胞发生凋亡^[7]。但Daudi细胞的生物学反应不尽相同。³H-TdR掺入结果表明，低浓度(＜20μg/ml)IgM刺激下，无血清对照组和10%血清组均无明显变化；而提高Igm浓度(≥20μg/ml)，二组细胞CPM值均呈现显著下降(图1)表明高浓度IgMI可明显抑制其生长(细胞死亡数＞细胞增殖数的结果。)

图1IgM对Daudi细胞生长的影响

光镜观察，二组细胞刺激后形态改变基本相同。加入IgM刺激数小时后，细胞于平皿中分布不均匀，成团状生长。24小时已观察到团状生长的细胞中，存在部分皱缩和形态不规则的细胞(图2a,2b)。至48～72小时，大量细胞呈死亡状态。而且随IgM浓度的升高，形态改变的细胞更多、更严重。这种形态学的改变与凋亡细胞相似，提示IgM可能具有诱导Daudi细胞凋亡的作用。

图2IgM刺激后Daudi细胞生长状态和形态的改变

a.对照;b.200μg/mlIgM刺激24小时

2.2IgM诱导Daudi细胞凋亡

为进一步证实上述镜下观察结果，应用FACS检测，进行Annexin V法和PI染色法同时分析。Annexin V结果显示，200μg/ml IgM刺激Daudi细胞72小时，约50％的细胞发生早期凋亡，对照组72小时未见凋亡发生(图3a)。PI染色DNA含量分析亦表明，实验组于72小时大量细胞发生凋亡，于G₀/G₁峰前出现一个小于2CDNA含量的区域，称为亚G₁峰，而对照组未见亚G₁峰(图3b)，结果表明IgM可诱导Daudi细胞发生凋亡。

图3 FACS分析IgM引起Daudi细胞的凋亡

a.Annexin V分析；b.PI染色分析

(注：1=坏死细胞；2=晚期凋亡；3=存活细胞；4=早期凋亡)

2.3IgM诱导Daudi细胞凋亡与细胞周期的关系

为探讨凋亡发生的机制，进一步应用Annexin V方法分析IgM刺激Daudi细胞发生凋亡的时间，并用PI染色法分析凋亡发生与细胞周期的关系。Annexin V结果可见，加入IgM后，大量细胞凋亡发生在48～72小时，而24小时内未见明显凋亡发生(图4a)。DNA含量分析显示，此阶段(48～72小时)G₀/G₁期和S期细胞数量比率差值最大(图4b)。48小时S期细胞增多，而72小时S期明显下降，G₀/G₁显著增高(表1)。显示凋亡的发生存在时间上的规律性。

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