【摘要】目的：进一步明确不同周期时相肿瘤细胞p16基因的表达水平及在细胞周期调控中的作用。方法：改进并建立了一个高同步率、高收获率的细胞周期同步化的方法^[7]，通过此方法把细胞同步在不同的时期，对RNA及蛋白的表达进行研究，确定在不同周期时相中p16的表达有何变化，同时分析其它几个重要的抑癌基因如p53、p21，研究它们在细胞周期中的表达以及与p16基因相互关系。结果：确定在不同周期时相的胃癌细胞系MGc80－3和BGC823细胞中，p16mRNA的表达随细胞种类的不同而有一定的差异，其蛋白在各周期时相中均有表达，在两种细胞中无明显差异。p53在各个周期时相的表达无明显差异，Waf1/p21的蛋白和mRNA的表达具有一致性，M期其mRMA不表达，而蛋白有微弱的表达。结论：以上结果表明在肿瘤细胞G1期CDK4活性的调节，可能主要不是发生在mRNA和蛋白表达水平上。

中图号：R735.2；R730.231文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)02－0116－05

Differential transcription of p16, Wafi/p21 and p53 genes through

the cell cycle in human gastric carcinoma cell lines

WANG Jun LI Wen mei LIANG Yun yan, et al

Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100034,China

【Abstract】Objective： To determine the expression of p16, Waf1/p21 and p53 genes in G1,S,G2/M phase of human gastric tumor cell lines,MGC803 and BGC82-3.Methods: The cells were synchronized in G1,S,G2/M phase by using high pressure N2O technique. Northern,Western blotting and immunofluorescence techniques was used to detect gene expression .Results: High efficient synchronizated cells were obtained and expreession of p16,Wafi/p21 and p53 genes were detected in the cells. Neither p16 mRNA nor its protein expression is changed during cell cycle progression of the MGC80-3.In BGC823 cell there is no detectable expression of p16 mRNA in M and G1 phase while p16 protein is constitutively expressed through the cell cycle. Similar with the expression of p16 mRNA, p53 mRNA expression is not Changed by cell cycle progression in the two cell lines ,although its exprexxion level in MGC80-3 is much higher in M phase than G1, S and G2 phases.Expression of p21 mRNA was detected in G1,S and G2 phases,but not in M phase,and the expression of p21 protein is lower in M phase than G1,S and G2 phases. Our data also show that p16 and p21 protein in G1 and S phase was located in cytoplasm and gathered to nucleus in G2 phase.Conclusion These results suggested that the regulation of CDK4 activity in G1 phase of human gastric tumor cells may not rely on the expression of mRNA and protein.

Key words:Gastric neoplasms;Cell cycle;p16;Wafi/p21

由于抑癌基因MTS1/p16的发现及对其功能的了解，人们逐渐把肿瘤发生与细胞周期联系起来，肿瘤细胞实际上是一些细胞周期异常的细胞，肿瘤的发生不仅是原癌基因活化和抑癌基因失活或丢失的结果，还包括细胞周期调控中Rb、p53和CKI(cyclin dependent kinase Inhibitor，周期蛋白激酶抑制因子)等一系列因子丧失活性，导致肿瘤抑制信号无法再对细胞周期中的调节蛋白家族(cyclins)/周期蛋白依赖性激酶家族(cyclin－dependent kinase, CDKs)进行调控，从而形成周期运转失控^[1，2]。

p16基因位于染色体9p21区，最初是在SV40转化的成纤维细胞中作为与CDK4相联系的蛋白而被发现^[3]，体外研究发现它能抑制CDK4和CDK6的活性^[4]。在许多类型的肿瘤中这一染色体区域都有异常，在黑色素瘤细胞系中p16的点突变与纯和缺失率达75％，其他肿瘤细胞系中这一比例也很高^[5]。另外，CpG岛的甲基化也被认为可能是使p16基因失活的重要机制^[6]

对p16在调节细胞增殖和诱导肿瘤发生中所起作用的研究很多，但对其表达的调节仍然知之甚少。由于p16是直接参与细胞周期的抑癌基因，因而对其表达的研究应以细胞周期为基础。但是由于以前的细胞周期同步化技术的局限，人们多是以混合的肿瘤细胞来研究p16基因的表达及功能，而不同的肿瘤细胞其周期时相有明显的差异，因而用混合细胞来研究p16其结果不具广泛性。我们改进并建立了一个高同步率、高收获率的细胞周期同步化的方法^[7]，通过此方法把细胞同步在不同的时期，对RNA及蛋白的表达进行研究，确定在不同周期时相中p16的表达有何变化，同时分析其它几个重要的抑癌基因如p53、p21，研究它们在细胞周期中的表达以及与p16基因相互关系，对了解肿瘤的发生与细胞周期的关系具有一定意义。

1材料与方法

1.1细胞培养及同步化

MGc80－3是山东师院建立的人胃低分化粘液腺癌细胞系，人胃癌BGC823细胞系为北京医科大学附属人民医院建立，为人胃粘膜腺癌细胞系，用含15％胎牛血清(天津血研所)DMEM培养基(GIBCO公司)，于37℃5％CO2恒温培养箱中培养。

MGc80－3细胞接种24～48小时后，先用过量TdR(2.5mM,Sigma公司)预处理，再于高压N2O条件下(37℃)培养一定时间，阻断细胞于有丝分裂期，经轻轻振荡，可获得大量有丝分裂期细胞。把所获的M期细胞继续培养5小时左右，细胞贴壁即为G1期。G1期细胞再以过量TdR(2.5mM,Sigma公司)进行阻断，释放后5小时及12小时分别获得S期和G2期细胞。各个处理间隔时间的选择是根据放射自显影的标记指数及有丝分裂指数动态测定的结果^[7]。

1.2免疫荧光分析

生长在盖片上的细胞，同步到不同时相，以冷丙酮(－20℃)固定后分别与p16多抗及p21单抗37℃孵育1hr，PBS漂洗后再与FITC标记的羊抗兔IgG或FITC标记的羊抗鼠IgG孵育45min，60％甘油/PBS封片，Olympus荧光显微镜观察并照相。

1.3Northern杂交分析

同步到不同周期的细胞，采用酚－异硫氰酸胍一步法提取RNA。15μgRNA样品经1.2％琼脂糖电泳分离，毛细管法转移至NC膜(S＆S公司)探针用[α-³²P]dCTP随机引物试剂盒标记，在含2.5mMK3PO4，5×SSC，5×Danhardt's，50μg/ml鱼精DNA，50％甲酰胺的杂交液中42℃杂交16～18小时，2×SSC，0.1％SDS室温洗2遍，0.1×SSC，0.1％SDS37℃洗两遍，－70℃压片曝光。

1.4Western杂交分析

同步到不同周期的细胞，用不含溴酚蓝的Laemmli sample buffer裂解。100μg蛋白样品经15％SDS－PAGE电泳分离，电转移至NC膜(S＆S公司)，分别与p16、p21抗体(Santa Cruz公司)反应，ECL化学发光系统(Amersham公司)检测信号。

2结果

2.1不同周期时相细胞形态及免疫荧光分析

M期细胞处于分裂状态，呈圆形，细胞与基质脱离，悬浮于培养液中。处于分裂中期的细胞中可见染色体明显的排列于赤道板上，免疫荧光发现p21和p16弥散于细胞中，染色体上为阴性。G1期细胞已完全贴壁，虽未完全伸展仍呈圆形，免疫荧光结果则发现p21与p16位于胞质。S期细胞DNA开始复制，此时的细胞已完全铺展，p16与p21虽仍位于胞质但逐渐向核膜靠拢。而G2早期的细胞仍较伸展，晚G2期的细胞则为圆形，p21和p16完全进入细胞核内(见图1，2，3，4)。

图1：MGc80－3细胞不同周期时相p16蛋白免疫荧光结果

a.M期(132×)，核膜消失，蛋白弥散于细胞内，蛋白位

于细胞内，而染色体上则为阴性；b.G1期(132×)，蛋白

位于胞胞质中；c.S期(330×)，则逐渐向核膜聚集；d.G2

期(132×)，蛋白完全位于核内。

图2：MGc80－3细胞不同周期时相p21蛋白免疫荧光结果

a.M期(132×)，核膜消失，明显可见染色体排于