【摘要】目的：研究外源性野生型p53基因对骨肉瘤细胞株生物学特性的影响。方法：采用基因转染技术，将外源性野生型p53基因重组质粒—PM47，导入人骨肉瘤细胞株HOS－8603细胞中，经选择培养基筛选阳性生长细胞克隆，用PCR技术检测PM47在转染后的瘤细胞内的存在情况；在相差显微镜和光镜下对转染前后瘤细胞的形态学进行观察和生长特性进行测定；用凋亡原位检测法检测瘤细胞凋亡率；流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；免疫组化法对转染前后瘤细胞p53、p21/WAF1、bax和bcl－2蛋白的表达进行定性和半定量检测。结果：转染后的瘤细胞形态由转染前密集排列的上皮样细胞转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度减慢，群体倍增时间比转染前增加了2.3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G1期；免疫组化检测结果发现转染后的瘤细胞p21/WAF1和bax蛋白的表达较强，而bcl－2蛋白表达受到抑制。结论：野生型p53是通过诱导p21/WAF1蛋白的表达和抑制bcl－2的表达从而调节细胞周期发挥抑瘤作用；诱导bax的表达启动细胞凋亡。

中图号：738.1文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)s0－0013－04

Effects of exogenous wild type p53 on behaviors of

osteosarcoma cell line

ZHU Quan sheng， QIU Ju shi， LIANG Hui zhen

Department of Pathology,Sun Yat sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,P.R.China

【Abstract】Objective： To study the effects of wild-type p53 on behaviors of osteosarcoma cell line.Methods： DNA transfection technique was used to introduce exogenous recombinant wild-type p53 plasmid,named as PM47,into osteosarcoma cell line HOS-8603. After culturing in selection medium,survivors were selected.PCR was used to detect the existence of PM47 in transfected tumor cells.The morphology of untransfected and transfected tumor cells was observed under contrast microscope and light microscope,and growth features were assessed. In situ cell death detection method was used to detect apoptotic cells. Flow cytometry was used to analyze the DNA contents and cell cycle of the cancer cells. Then,immuno-histochemical technique was used to detect expression of p53,p21/WAF1,bax,bcl-2 proteins in untransfected and transfected tumor cells.Results：Phenotype of transfected tumor cells changed into long spindle-shaped from untransfected epithelial-like cells.The transfected tumor cells grew slowly,detached easme were going into apoptosis.The transfected tumor cells mostly arrested in G1 phase by analysis of Flow Cytometry. The immunohistochemical results indicated that the p21/WAF1,bax proteins were detected stronger positive,but expression of bcl 2 protein was suppressed in trasnsfested tumor cells.Conclusion：Wild-type p53 induces expression of p21/WAF1,acts as an inhibitor of cell cycle progession,inhibits expression of bcl-2,to result in growth inhibition,induces expression of bax to trigger apoptosis.

Key words： p53； Bone tumor； Cell cycle； Growth inhibition； Apoptosis

在骨肉瘤术前、术后化疗中发现，部分患者对化疗药物无反应性，部分患者开始对化疗药物敏感，但随着化疗方案的实施，肿瘤细胞逐渐产生对该化疗药物甚至多种化疗药物的耐药性，诱导多药耐药(multidrugresistance,mdr)基因的表达，mdr严重制约着骨肉瘤患者的疗效和预后。因此，有必要从分子生物学的角度寻求一种治疗骨肉瘤的方法〔1〕。本文采用基因转染技术在体外培养的条件下，将重组野生型p53基因质粒PM47，导入国人自己培养的有p53基因缺失的人骨肉瘤细胞株HOS8603〔2〕细胞中，观察野生型p53基因对瘤细胞生物学特性的影响。

1材料和方法

1.1转染用质粒DNA的准备

重组野生型p53基因质粒-PM47，由刘子君提供。我们将其转化到大肠杆菌HB101，并从中扩增、提取、纯化闭合环状PM47质粒DNA用于转染实验〔3〕。

1.2PM47质粒DNA转染人骨肉瘤细胞株

1.2.1受体细胞：人骨肉瘤细胞株HOS-8603从上海第二军医大学病理学教研室引进，该细胞株能在裸鼠成瘤并能成骨〔2〕。

1.2.2转染试剂及转染前准备：按DOTAPDNA转染试剂盒(购自德国BoehringerMannheim)说明书操作，每次准备4管转染混合物。

1.2.3转染骨肉瘤细胞株：骨肉瘤细胞转染前进行传代，在细胞贴壁面积达70.80％满时(大约106个HOS-8603细胞)，换含转染混合物的培养液，以PBR322质粒DNA作阴性对照，未加试剂作空白对照，6小时后换选择培养基，此后每3天换一次选择培养基，两周后挑选阳性生长细胞克隆，换含20％小牛血清的RPMI1640培养液，常规培养。

1.3转染前后骨肉瘤细胞株p53第6外显子PCR扩增

常规提取PM47质粒DNA、转染前、转染后的第1代和第6代瘤细胞DNA，对p53基因第6外显子进行PCR扩增，检测PM47在瘤细胞中的存在情况。

1.4转染前后骨肉瘤细胞的形态学观察、生长曲线测定和凋亡细胞原位检测

每日在相差显微镜下对转染前后的瘤细胞进行形态学观察，照相记录，常规绘制瘤细胞生长曲线并计算瘤细胞群体倍增时间。每日准备细胞爬片，按细胞凋亡原位检测试剂盒(TUNEL法)说明书操作，进行凋亡细胞原位检测，BCIP/NBT显色，核固红复染，嘭镜下计算凋亡率。

1.5流式细胞仪测定转染前后骨肉瘤细胞DNA含量和细胞周期

取转染前和转染后的第1代、第6代骨肉瘤细胞悬液，在流式细胞仪上进行DNA含量和细胞周期测定，并打印图表和数据。

1.6转染前后瘤细胞中p53、p21/WAF1、bax和bcl-2蛋白的免疫组化检测

采用LSAB法对转染前后的瘤细胞分别进行p53、p21/WAF1、bax和bcl－2的免疫组化检测。抗p53抗体DO－7(鼠抗人单抗)、bcl－2(鼠抗人单抗)和LSAB试剂盒购自DAKO公司；抗p21/WAF1(鼠抗人单抗)和bax(兔抗人多克隆抗体)抗体购自美国OncogeneScience公司。

2结果

2.1PM47质粒DNA转染到人骨肉瘤细胞株中

PM47质粒DNA转染到人骨肉瘤细胞株2周后有一些细胞克隆存活下来，而转染PBR322质粒DNA和未转染的骨肉瘤细胞株均不能在选择培养基中存活2周。挑选存活下来的阳性瘤细胞克隆，命名为HOS8603－P。

2.2转染前后骨肉瘤细胞中p53基因第6外显子PCR扩增结果

用PCR方法在转染前的骨肉瘤细胞株中不能扩增出p53基因第6外显子DNA片段，而在PM47质粒、转染后的第1代和第6代瘤细胞内均能扩增出一条136bp的DNA片段，证实转染成功〔3〕。

2.3转染前后骨肉瘤细胞形态、生长特性和凋亡情况

2.3.1瘤细胞形态：在相差显微镜下观察，转染前骨肉瘤细胞主要为多边形或三角形，类似上皮样紧密排列(见图1)，并见瘤细胞有重叠生长的能力；而转染后的骨肉瘤细胞却变成长梭形，细胞排列稀疏，胞浆增多平铺或脱壁，未见重叠生长现象，细胞生长缓慢，并可见散在瘤细胞凋亡(见图2)。

图1转染前HOS-8603瘤细胞为多边形或三角形类似上皮样紧密排列相差×200

图2转染后HOS8603P瘤细胞为长梭形，细胞排列稀疏，并见散在瘤细胞凋亡相差×200

2.3.2瘤细胞生长曲线和群体倍增时间：从生长曲线(略)可见，转染前的骨肉瘤细胞群体倍增时间为21.7小时，而转染后的骨肉瘤细胞群体倍增时间为72小时，转染后比转染前增加了2.3倍。

2.3.3凋亡瘤细胞原位检测用凋亡原位检测法检测，见凋亡细胞核染成紫兰色，而未凋亡瘤细胞核染成红色(见图3)。统计分析发现，转染前瘤细胞的凋亡率为2.12％±1.43％，而转染后瘤细胞凋亡率达12.36％±2.47％，经t检验，P＜0.01,差异显著。

图3转染后的瘤细胞出现散在瘤细胞凋亡，凋亡细胞核染成紫蓝色TUNEL×200

2.4流式细胞仪<