中华病理学杂志2000年第29卷第3期

沈忠英沈健陈铭华李乔山洪超群

摘要目的通过研究食管癌细胞株SHEEC1细胞凋亡早期线粒体的形态改变和bcl-2、bax的表达，以了解三氧化二砷（As₂O₃）作用于食管癌细胞的机制。方法食管癌细胞株SHEEC1用1、2、3μmol/L As₂O₃作用2、4、6、12、24 h。用Annexin-V荧光探针，流式细胞仪和DNA组方图检测早期凋亡细胞；光镜和电镜检测凋亡细胞的形态学改变；用罗达明（Rhodamin123）荧光探针检查活细胞线粒体的改变；用免疫组织化学SP方法检查bcl-2和bax的表达。结果SHEEC1细胞经As₂O₃作用24 h出现细胞凋亡的典型形态改变。4 h可用Annexin-V查出早期凋亡细胞。线粒体的超微结构改变如下：As₂O₃作用2～4 h内线粒体增生，伴有电子密度高物质出现在基质，是早期细胞损伤的现象。作用6 h线粒体进行性肿胀，12 h出现气球样外观，甚至外膜破裂。不同剂量皆引起损伤脱落细胞bcl-2表达下调和bax上调。结论由As₂O₃诱导的SHEEC1细胞凋亡，线粒体形态改变是早期改变，细胞凋亡和bax表达上调及bcl-2表达下调有密切关系。

关键词：食管肿瘤；脱噬作用；线粒体；原致癌基因蛋白质c-bcl-2；肿瘤细胞，培养的

近年来用三氧化二砷（As₂O₃）治疗急性白血病已引起人们的重视^［1，2］。其治疗机制是诱导肿瘤细胞凋亡^［3，4］。我们曾报道As₂O₃诱导食管癌细胞凋亡，主要表现在细胞核超微结构改变^［5，6］。最近我们发现As₂O₃诱导食管癌细胞凋亡过程中线粒体的改变^［7］。我们拟通过研究As₂O₃诱导细胞凋亡的早期改变，重点在线粒体的形态改变及bcl-2、bax的表达，以阐明As₂O₃引起食管癌细胞凋亡的作用点，并证实As₂O₃是一种线粒体毒性药物。

材料与方法

1．细胞系和用药方法：食管癌细胞系SHEEC1是我室用HPV18 e6E7和TPA 协同诱导胚胎食管上皮恶性转化细胞^［8］，在M199培养基中加10％小牛血清培养传代。As₂O₃（Sigma公司产品， lot A1010）用培养基配成1、2、3 μmol/L。用药方法：细胞培养在250 ml培养瓶和24孔塑料培养板（Corning公司产品），内置盖玻片，每孔接种细胞5×10⁴个，分1、2、3μmol/L 3浓度As₂O₃组及1组对照，在第2、4、6、12、24 h取标本检查。

2．透射电镜检查：收获细胞离心成团，2.5％戊二醛固定，常规电镜制样，日立H-300电镜检查。

3．流式细胞仪检查：DNA倍体测定按常规制样，碘化丙锭（propidium iodide ，PI）染色，检查细胞周期和凋亡峰。Annexin V检测：取培养细胞10⁶用PBS洗，200 r/min离心5 min。Annexin-V-Fluos标记试剂盒购自Boehringer mannheim公司，按试剂盒方法作活细胞染色。流式细胞仪（FACSort，B-D公司）检测。

4．罗达明123 (Rhodamin123，Rho123）荧光探针标记：Rho123， MW381 ，Molecular Probes公司产品。细胞在24孔板盖玻片上生长。1、2、3μmol/L As₂O₃作用，定时取片，PBS洗涤，Rho123（10μg/ml）染色，在37℃， 5％ CO₂培养箱温育30 min，PBS洗3次，在落射荧光显微镜（Nikon fluophot）下检查，激发光505 nm，发射光534 nm。

5．免疫组织化学检查：用细胞离心机（Cytospin Ⅲ,美国Shandon公司）收集脱落细胞，4％多聚甲醛固定。bcl-2、bax兔抗人多克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒（Santa cruz公司产品）购自北京中山生物技术公司，按试剂盒操作方法，并设阳性和阴性对照。脱落细胞另作苏木素细胞核染色。

结果

1．凋亡细胞的形态改变：SHEEC1加不同浓度As₂O₃后24 h均出现细胞凋亡，多数细胞核染色质凝集靠边呈典型凋亡细胞核改变（图1）。

2．细胞凋亡的指标：1 μmol/L As₂O₃作用早期凋亡细胞较少，As₂O₃2 μmol/L作用4 h Annexin V显示早期凋亡细胞占7.1%。DNA组方图显示细胞凋亡峰，12 h凋亡细胞7.5％，24 h凋亡细胞 35.0％。3 μmol/L As₂O₃作用细胞易进入凋亡后期改变。

3．线粒体Rho 123荧光标记：加药后2 h线粒体数目增加， 4 h出现有粗大线粒体，多在胞质外带（图2）。12 h及24 h线粒体外形结构不清。

4．细胞超微结构改变：不同浓度As₂O₃作用后2～4 h，线粒体数目增多，大小不一，椭圆形、双层膜和内嵴清晰（图3），有的线粒体肿胀，内嵴减少缩短，有电子密度高的不定形物质沉淀，细胞核染色质开始凝集（图4）。作用6 h可见线粒体肿胀，嵴消失；12 h外膜消失，基质透明呈气球样，并可见自噬泡。核染色质凝集成块及开始靠近核膜（图5），作用24 h细胞皱缩，核变圆，染色质凝集靠边，出现凋亡的改变（图6）。1μmol/L As₂O₃作用，病变发展较慢，而3 μmol/L As₂O₃作用病变发展较快，病变发生时间缩短。

5．bcl-2和bax的表达：不同浓度As₂O₃作用2、6、12、24 h时收集细胞，bcl-2蛋白产物免疫组织化学检测呈阴性（图7），bax蛋白产物免疫组织化学染色呈深褐色，为高度表达（图8）。

讨论

细胞凋亡是一个发展的过程，有其早、中、晚期的改变，不同浓度的As₂O₃作用于SHEEC1细胞系4～6 h时出现凋亡早期改变：形态学上细胞完整，结构清晰，细胞核染色质轻度凝集，线粒体增多，肿胀，基质有致密物质沉积，有溶酶体自噬泡。Annexin-V染色流式细胞仪检查，证实磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外露。Rho123荧光探针显示在凋亡早期线粒体增生和肿胀。3 μmol/L As₂O₃作用24 h凋亡细胞出现晚期改变：多数细胞死亡，出现典型的细胞凋亡改变，如细胞皱缩，细胞核变圆，染色质凝集靠边，核膜不完整。线粒体空泡化或外膜破裂呈气球状，胞质呈退行性变。

线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸链、电子传递，三羧酸循环和氧化磷酸化的场地，也是产生能量的场所，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动^［9］。线粒体膜通透性改变和跨膜电位改变使线粒体肿胀，位于线粒体内外膜间隙的细胞色素c进入胞质，激活某些蛋白酶系统（caspases）^［10］，是凋亡产生的起源。细胞核改变是核酸酶进入核内使染色质致密化和DNA断裂^［11］。

Rho123是一种分子探针，属于慢反应膜电位荧光探针，用以检测线粒体内侧负电荷。它不但可以显示线粒体的形态，也可通过线粒体内荧光强度的改变，计算膜电位的增减，反映线粒体膜的通透性，是研究线粒体形态和功能的良好试剂。

我们多次检查不同浓度As₂O₃作用于食管癌细胞系造成的损伤细胞，皆出现bcl-2表达下调和bax表达增加，证实这两者参与了细胞凋亡的过程。bcl-2可以预防细胞凋亡^［12］，bax能促进线粒体膜通透性改变，使细胞色素c释放引起细胞凋亡^［13］。bcl-2/bax互相拮抗，其作用位置在线粒体，两者皆为细胞凋亡的调节基因。

图1SHEEC1细胞加2 μmol As₂O₃作用24 h出现多数凋亡细胞,细胞皱缩,细胞核变圆, 变小,染色质凝集成块,靠边苏木素×400

图2SHEEC1细胞加2 μmolAs₂O₃作用4 h活细胞Rhodamin荧光探针图象。左侧细胞线粒体增多,肿大,右侧改变不明显Rho123×1000

图3SHEEC1细胞加2 μmol As₂O₃作用 6 h图像出现线粒体增多,分布不均,大小不一,膜结构和嵴保存，细胞核染色质未见凝集×15 000

图4密集线粒体轻度肿胀,结构模糊，周围细胞质电子密度增加×20 000

图5SHEEC1细胞加2 μmol As₂O₃作用6 h，线粒体肿大,内嵴消失,有的剩单层膜, 呈气球状,核染色质凝集×15000