CSCO2000年第四届学术年会

易铁男¹（综述） 周云峰²（审校）

关键词：端粒酶活性；诊断；治疗；检测方法；化疗；放疗

人的染色体末端包含短的DNA重复序列叫做端粒，端粒的DNA在功能和结构上不同与其他的DNA序列，所有的真核的生物，从酵母到人体组织，端粒表现均是高度保守的重复序列，端粒DNA随着细胞的分裂而逐渐缩短，这种端粒的损耗可能起着“分裂钟”的作用。由于末端的DNA 序列进行性丢失和染色体完整性的逐渐缩短，大多数正常细胞可能被限制分裂。但癌细胞和永生化细胞则可维持其端粒长度，这是由于癌细胞和永生化细胞以及生殖细胞等表达一种重要的核糖核蛋白（ribonucleoprotein）酶即端粒酶。端粒末端序列的完整性由端粒酶来维持。端粒酶由蛋白质和RNA两部分组成，为一种具有逆转录活性的核糖核蛋白酶，含有引物特异性识别位点，能以自身RNA为模板合成端粒DNA的末端重复序列。虽然端粒酶靠自身的活性在哺乳动物发育中没有表现出直接的生物学的作用，但在细胞分裂过程中细胞的生存和器官的体内平衡需要靠足够的端粒结构来维持。大量研究证实人体大多数癌和其他恶性肿瘤中均能检测到端粒酶活性，而良性肿瘤和正常组织体细胞（非生殖细胞）缺乏或存在微弱的端粒酶活性。因而许多学者认为端粒酶活性与正常细胞转化成永生化的肿瘤细胞之间的强烈联系，使端粒酶成为肿瘤诊断的标志物，疗效的判定参数及治疗的新靶点，肿瘤预后判定的有价值的指标。

端粒酶活性的检测方法

端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯度。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒酶重复序列扩增法（Telomeric repeat amplification protocal,TRAP），使灵敏度提高了一万倍。标准的TRAP分析有二个步骤：（1）用去污剂裂解待检细胞制备出含端粒酶的提取液。（2）用提取液延伸引物TS（5’-AATCCGAGCAGGAGTT-3’）。目前这一方法已成为端粒酶检测的主要方法。此后许多学者又进行了改进，建立了染色法、荧光法和ELISA法。ELISA法是德国宝灵曼公司向市场推出的利用DIG标记引物，用定量检测端粒酶活性的试剂盒使用的方法。国内卫立辛等将TRAP与常规ELISA发结合，建立了端粒酶TRAP-ELISA法，该方法特异、敏感、快速。随着PCR为基础的端粒酶评价（TRAP）方法的改进，则能在多种多样的标本中检测端粒酶。原位杂交和RT－PCR使端粒酶RNA和端粒酶催化亚单位mRNA检测已变得容易对存档组织中端粒酶活性评价。进一步可得到的制成石蜡包埋组织的抗体使能够进行相对半定量分析。使端粒酶活性与组织细胞形态结合起来观察^[1]。最近Soriac等对转移性乳腺癌的病人通过外周血单核细胞俘获的上皮细胞检测出端粒酶阳性，特异性和敏感性均较高且为非侵入性的方法，为端粒酶的检测提出了一新的途经^[2]，为临床提供更广泛和方便的运用。人类端粒酶包括三个主要部分,即人端粒酶RNA(hTR),端粒酶相关蛋白(TP1)和人端粒酶催化亚单位（hTERT）。hTR在所有的细胞中均表达，因此它不能作为端粒酶活性的预测指标；TP1尽管在脑组织中表达相对较弱，但在大多数组织中表达。Kyo等^[3]观察了35例卵巢癌，5例低度恶性肿瘤，11例良性病变和12例正常组织。hTERT仅表达在卵巢癌，而hTR和TP1在癌性和非癌性组织中均有表达，提示端粒酶的活性与hTERT相关，不与hTR和TP1相关。hTERT上调对卵巢癌的发生起重要作用。同样Sumi DA等对26例口腔恶性肿瘤的分析也表现出hTERT与端粒酶活性紧密相联系，并提示检测hTERT用RT-PCR比TRAP更灵敏和准确^[4]。

2 端粒酶活性与肿瘤的诊断

2．1端粒酶活性与肿瘤组织良恶性的判定

端粒酶几乎在所有类型的肿瘤中均有不同程度的表达。近几年来，通过对上万例的不同来源的原发肿瘤进行端粒酶的活性测定，表明恶性肿瘤组织中阳性率高达85%~90%。在良性病变中，阳性率仅为4.2%。Shay等^[5]总结3500例恶性肿瘤及其对照的端粒酶活性，90%以上的恶性肿瘤表达端粒酶活性。而相应的良性肿瘤则为阴性或仅有少数阳性。国内学者在这一方面也做了大量工作。吴珊等^[6]报道大部分乳腺癌端粒酶活性呈阳性而乳腺良性癌变则呈阴性。赵东兵等报道大肠癌中端粒酶活性呈阳性而癌旁组织端粒酶阴性。国外肝癌、胰腺、肺癌等均有类似的报道。但对人体肉瘤的研究与癌组织有差异，Yan等发现良性软组织肿瘤和低度恶性的肿瘤均不表达端粒酶活性，仅50%的中度和高度恶性的肉瘤表达端粒酶活性，平滑肌肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤很少表达端粒酶活性^[7]。以上资料显示端粒酶在癌组织中的强表达给病理学鉴别病变的良恶性提供了一个很好的标志物，但对于肉瘤组织用目前常规的检测端粒酶方法鉴别病变的良恶性还需要进一步的研究。多数资料表明端粒酶hTRT的表达与肿瘤有很好的相关性^[8]。

2．2端粒酶活性在脱落细胞检测中的应用

脱落细胞的标本来源广泛，包括：（1）器官分泌物如唾液、痰液、尿液、脑脊液、宫颈分泌物；（2）病理性体液：胸、腹水；（3）肺泡、膀胱、胃肠道、鼻窦等冲洗物；（4）细针穿刺物如乳腺、前列腺、甲状腺、淋巴结等。Yang[9]等对144例胸腔积液的标本行端粒酶活性检测，70例恶性胸水中检出64例（91.49%），良性（3/52）为5.8%，病理可疑恶性胸水端粒酶阳性20/20，敏感性和特异性分别为91.4%和94.2%。Yahata[10]等报道20例肺癌胸膜转移的支气管灌洗液中端粒酶阳性18（82%），端粒酶活性在周围型肺癌中检出11/14（79%），中央型肺癌中7/8（88%），表明利用支气管灌洗液可对肺癌病人早期诊断，而且端粒酶水平与肿瘤位置无关。王强等报告恶性腹水中端粒酶活性阳性88.9%，明显高于细胞阳性55.6%，端粒酶为诊断恶性腹水有效而敏感的方法。Rahat[11]等报告尿液中端粒酶阳性达81%，尿脱落细胞中检测端粒酶能获得比细胞学敏感性高的多的结果。显示端粒酶检测在脱落细胞中应用的良好前景, 尽管如此，直接将端粒酶用于临床诊断还有大量工作要做。

3 端粒酶活性与肿瘤的治疗

端粒酶与肿瘤的发生、永生化和恶性程度有直接的关系，也是肿瘤生长和转移的关键。端粒酶有预测肿瘤进展的功能，它也可作为一有价值的工具测量化疗和放疗对肿瘤侵袭性的影响。对于临床它将是很重要的参数，用于判断肿瘤对放化疗的敏感性，监控肿瘤辅助治疗疗效，以及对治疗方案、间隔、疗程提供帮助。

3.1化疗疗效与端粒酶活性的关系。

癌症病人化疗与端粒酶活性关系已有多篇文章报导， 多数文献认为癌症病人化疗后端粒酶活性下降，Hoose等^[12]通过对25例化疗和非化疗的乳腺癌的病人肿瘤端粒酶活性定量分析，发现随着肿瘤的进展端粒酶活性增高，所有经过化疗的病人肿瘤端粒酶活性均降低。Zhang^[13]等检测了356例AML病人的单核细胞中端粒酶，发现41例表现端粒酶阳性，端粒酶活性高的病人对化疗抗药并且预后很差，而端粒酶活性低的病人预后好。端粒酶活性与化疗耐药的关系，Ishikawa等^[14]运用人乳腺癌MCF-7和ADM耐药的MCF-7细胞系，用ADM、5-FU 和Taxol治疗，MCF-7细胞系用ADM和5-FU治疗后端粒酶活性下降；AdrR的细胞系5-FU和Taxol治疗端粒酶活性下降，而ADM治疗后端粒酶活性增高，同时检测出Bcl-2表达，提示端粒酶活性与药物的耐药有关。从上述文献可以看出，端粒酶活性可作为一有价值的临床化疗的观察指标，以指导治疗方案、选择敏感的化疗药物和疗后评价。

3.2放疗疗效与端粒酶活性的关系

放射治疗的疗效与端粒酶活性有密切关系，Oguwa等^[15]报道对25例进展期的口腔、口咽鳞癌，在放疗前，放疗4Gy或／和20Gy时取活体标本定量检测端粒酶，25例病人中，19例阳性，放疗20Gy时，9例病人的肿瘤组织持续端粒酶阳性（>10TPGu/mug蛋白质），这9例中8例对放疗反应差，且在短期内局部复发，另一组显示低水平或无活性的11例病人有9例病人对放疗反应好，在接近21个月的随防中他们无一例复发，提示放疗20Gy时端粒酶活性增高对放射不敏感，放疗疗效差。Kagka等^[16]对头颈部癌放化疗后端粒酶活性研究发现，完全缓解3例和部分缓解1例，均检测不出端粒酶，而无变化的7例均可检出端粒酶活性，表明治疗抗拒的肿瘤有高的端粒酶活性和更恶性的潜能。从临床放射学的角度看，放疗所至肿瘤内端粒酶高水平表达的肿瘤对放射更抗拒，治疗后局部易复发，放疗疗效差。因此端粒酶可作为临床放射敏感性的预测指标和疗效评价参数。

3.3以端粒酶为靶点的抗肿瘤治疗

由于端粒酶特异性地表达于绝大多数肿瘤细胞，又是肿瘤细胞无限增生所必须的，所以以端粒酶为靶点的抗肿瘤药物成为近来肿瘤治疗研究的热点，抗端粒酶治疗，具有广谱、高效，低毒的特点，虽然端粒酶抑制剂的研究还处实验阶段，这一领域具有很好的临床前景，已发现和进行研究的端粒酶抑制剂包括反义核苷酸，核酶、核苷类似物，逆转录酶抑制剂，蛋白激酶C抑制剂，细胞分化诱导剂，以及端粒酶受体蛋白等。美国多家生物技术和药物公司已着手开发该类药物，但抗端粒酶治疗也有值得注意的问题，除肿瘤细胞端粒酶表达外，在正常人类生殖细胞，造血干细胞，淋巴细胞及小肠上皮细胞等有再生能力的细胞中，均可检测到不同水平的端粒酶活性，抗端粒酶治疗也对这些细胞产生副作用；另一个问