CSCO2000年第四届学术年会

蒋 芹黄小民匡久树葛旭明李小民张为民谢晓东刘淑华

摘要：目的：MTT法体外药敏试验指导下胃肠癌的预见性化疗。方法：取27例新鲜胃肠癌标本进行体外MTT法药物敏感试验，设为MTT试验组；27例同期胃肠癌患者作经验对照组。试验组按药敏试验结果化疗，耐药者按临床经验化疗；对照组按临床经验化疗。结果：27例药敏试验完成实验，药敏阳性者胃癌8例，肠癌5例；阴性者胃癌7例，肠癌7例。临床化疗结果：耐药者中有诳率14.3%，经统计学处理χ2=10.7，ρ＜0.01，差异显著；试验组总有效率为44.4%，经验对照组化疗后有效率为25.9%，经统计学处理，χ2=9.5，ρ＜0.01,两组疗效差异显著。MTT实验结果与临床化疗结果的符合率：81.48%（10+12/27）。结论：MTT法测癌细胞对抗癌药的敏感试验可以预见胃肠癌的化疗。

关键词：胃肠癌；化学治疗；MTT比色法；药物敏感试验；胃癌；肠癌；预见性化疗

胃、肠癌是常见肿瘤之一，属于化疗低敏类恶性肿瘤，由于发现时多已属于中、晚期，单纯手术的疗效甚差，化疗作为综合治疗的重要组成部分，是当前治疗胃、肠癌的主要方法之一。为提高胃、肠癌的化疗疗效，实行个体化治疗，我们对27例中、晚期胃、肠癌进行个体化治疗，取其新鲜癌细胞体外原代培养，MTT法测定抗癌药物其对癌细胞的敏感性，筛选敏感药物用于化疗，同期末做药敏试验者35例胃、肠癌患者采用经验方作对照研究，现将结果报告如下：

1、 材料与方法

1、1材料：

1、1、1临床资料

从1995年12月至1999披月共收取胃、肠癌细胞标本27例。取自手术切除标本21例、胃肠镜活检标本6例。胃癌15例Ⅲb期7例，手术切除可见病灶、Ⅳ期8例，枯息性手术，Ⅳ期病例术中发现肝转移3例、腹腔内淋巴结广泛转移4例，胰腺及脾门同时受侵1例。病理报告为末分化癌5例，腺癌5例，粘液腺癌3例，粘液癌2例。大肠癌12例，Dukes'分期均为C期，其中肝转移4例，与周围严重粘连并腹腔淋巴结转移不能切除者3例，伴腹腔广泛转移作枯息性手术者5例。腺癌7例，粘液腺癌5例。年龄32岁至65岁，平均为57岁；卡氏评分75±5分；选同期末作MTT法测定的Ⅲ期胃癌15例，其中12例接受根治术，3例以年龄大为借口拒绝手术治疗，病理结果为末分化癌4例，低分化腺癌4例，粘液腺癌3例，粘液癌4例。大肠癌12例，均为手术后患者，腺癌症9例，粘液腺癌3例，Dukes'分期均为C期。两组有可比性。

1、1、2实验室资料

主要试剂： MTT由Sigma公司提供,RPMI1640培养液由、DMOS（二甲亚砜）、MMC（丝裂霉素）、ADM（阿霉素）、CPT（羟基喜树硷）、VCR（长春新硷）、DDP（顺铂）、MTX（甲氨碟呤）、5-Fu（5-氟脲嘧啶）。美国生产全自动CO2孵箱一台、酶标检测仪DG-3022型（λ=490）、300目细胞分离器、96孔培养板。

1、2方法：

1、2、1实验室方法

取新鲜癌细胞经机械分离、纯化成单细胞悬液，活细胞计数，调节细胞浓度至2-5×105/ml，短期癌细胞原代培养，加入10%小牛血清的RPMI-1640经轻吹混均后置96孔培养板中，每组药最少占6孔，设空白对照组。37°C、CO2孵箱中培养16-24小时，分别加入按血峰值浓度预先配制好的各种药物，[药物血浆峰值浓度D（μg/ml)=50×（D·mg/kg）÷5000×2×103]，继续培养48小时后于终止培养前加入MTT试剂染色细胞，作用30分钟后加入DMSO溶解生成的甲攒，酶标仪测定其OD值，计算抑制率[抑制率=（对照组均数-实验组均数）/对照组均数×100%]，抑制率在30%以上者为药敏阳性；抑制率在30%以下者为药敏阴性或耐药。

1、2、2临床化疗分组方法

设MTT药物敏感试验组及经验方案对照组：根据药物敏感组成化疗方案，MTT试验耐药者及对照组按经验方案用药：经验方胃癌为MMC、5-Fu、ADM，大肠癌为5-Fu、MMC、DDP或CPT、5-Fu、DDP。每组完成三周期化疗评价疗效。

1、3临床疗效评价

按WHO制定的化疗疗效评价标准评价疗效〔1〕，完全缓解CR+部分缓解PR，为有效患者；NC为无变化；PD为进展。毒副反应按WHO制定的标准评价。

1、4统计学方法

采用卡方统计学处理，χ2检验各组疗效差异。

2结果

2、1实验结果

3、1、1癌细胞原代培养MTT法测定药敏结果: 15例胃癌药敏阳性8例占53.3%，阴性7例占46.7%；12例大肠癌药敏阳性者41.7%，阴性者占58.3%。

3、1、2实验经验教训总结

在标本的处理过程中标本污染是导致实验失败的主要原因，接受大肠癌标本15例，污染3例，均在培养中发现细菌污染，考虑大肠癌组织受粪便污染，在去污洗涤中应多次重复洗涤以去除杂菌，才能保证实验成功；其次标本离体后应尽快进行实验，以确保细胞活力，放置越久细胞活力下降，影响其修复功能势必影响结果的精确性；癌细胞的纯化过程也十分重要，其中关键是消化酶作用时间的掌握，我们的经验是在倒置显微镜下见到成纤维细胞伪足回缩后2-3分钟结束消化，以免过分消化损伤癌细胞而出现假阳性结果。

2、2临床各组疗效结果比较

2、2、1药敏阳性组与耐药组疗效比较

药敏阳性者共13例：胃癌8例，临床CR0例、PR6例，有效率75%（6/8）；大肠癌5例，临床CR0例、PR4例，有效率为80% 药敏组总有效率为76.9%。药敏阳性的13人所用方案均取敏感性最强的前3种药进行化疗。耐药组中仅一例胃癌、一例大肠癌达PR，余均为无效病例，有效率为14.3%。实验组总有效率44.4%（12/27）。敏感组与耐药组经统计学处理：χ2 =10.7，P＜0.01有高度显著性。说明此实验有重要的临床价值。

2、2、2药敏阳性组与经验组临床疗效比较

经验组临床疗效：胃癌15例中CR0例，PR 4例，NC8例，PD3例，有效率为26.7%；大肠癌12例中CR0例，PR3例，有效率为25%，经验组总有效率为25.9%（7/27），药敏组为76.9%（10/13）。两组疗效比较经统计学处理，χ2= 9.5，P＜0.01，差异有高度显著性，说明按药敏结果化疗有重要的临床意义。

2、3实验结果与临床相关性: MTT所测药敏结果与临床的实际符合率为81.48%（10+12/27）。此结果提示实验结果与临床成正相关，有指导临床进行化疗的实用价值。

2、讨论

胃癌、大肠癌属于对化疗不敏感的恶性肿瘤，而临床收治的患者往往已属晚期，无论采用何种治疗方案均有相当比例失败患者，因为临床医生在没有实验指导下很难做到精确选取有效药物，为解决这一临床难题，预测不同患者的化疗疗效，进行个体化治疗，我们用患者的癌细胞悬浮液进行原代培养，采取具有方便、快速、简易、准确的MTT法测试癌细胞对各种药物的敏感性这一难题〔2〕，药敏阳性者化疗有效率达76.9%，而耐药组仅为14.3%、经验组25.9%，P＜0.01，差异高度显著，说明其临床意义重大，实验药敏结果与临床疗效的符合率为81.4%，与徐建明〔3〕等人的报道相似。根据药敏结果，敏感阳性的13例患者分别用了13种不同的方案，根据药敏结果指导临床化疗，具有极强的针对性，排除了个体差异，明显提高了疗效。如能对每例患者同时进行耐药基因测定，临床予以药物逆转将更能提高疗效，有待进一步研究。本研究组中根据MTT药敏结果治疗后的结果中了出现5例与实验结果不符合病例，说明存在假阴假阳结果，分析原因可能与癌细胞纯化不够，细胞悬液中存有少许成纤维细胞及血细胞，影响癌细胞营养供应，造成假阴性；其次机械性分离细胞，部分细胞受机械损伤导致细胞修复能力下降引起假阳性；再之，离体细胞不受机体内环境影响，将体外结果用于临床存在差距但这种差距与凭经验化疗所致的差距要小的多。总之，此法此法可使临床不在使用无效疗药物，并为临床提供可靠的用药依据，使化疗总体水平有所提高。

作者单位：连云港市第一人民医院 222002

参考资料

[1]Miller AB,Hoogstraten MB,el al. Reporting result of cancer treatment. Cancer ,1981,47:207

[2]Wilson J K. Sargent J M.Eligie A W.et al.A feasibility study of chemosensitivity testing in ovarian malignancy. Br J Cancer,1990, 62:189.

[3]徐建明，宋三泰，汤仲明等，MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗[J].中华肿瘤杂志,1997,19:153.