第二军医大学学报2000年第21卷第6期

魏林戴建新孙树汉

摘要目的：构建新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶(HN)基因真核表达质粒，并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。方法：用RT-PCR从NDV中克隆HN cDNA，并构建HN的真核表达载体，转染COS-7细胞表达。注射至小鼠B16黑素瘤模型，检测其抗肿瘤作用。结果：成功地克隆了NDV HN cDNA，所构建的pcDNA3-HN有良好的表达，动物实验显示，pcDNA3-HN有增强荷瘤小鼠CTL，NK杀伤活性的作用。结论：NDV HN的真核表达质粒具有增强荷瘤小鼠抗肿瘤CTL，NK细胞反应的作用。

关键词：新城疫病毒；血凝素类，病毒；神经氨酸酶；抗肿瘤作用

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)具有诱导IFN，TNF，IL-2等多种细胞因子的作用^［1，2］，将NDV或其包膜表面糖蛋白血凝素神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase， hN）转入或修饰肿瘤细胞(NDV-modified autologous tumor-cell vaccine, aTV-NDV)，经动物实验及临床应用均证明可以增强肿瘤特异性CD8⁺ t 淋巴细胞（CTL），CD4⁺ T辅助淋巴细胞的活性^［3～5］。本实验通过RT-PCR获取了NDV的HN基因,并构建了HN的真核表达质粒pcDNA3-HN。通过动物实验，初步探讨了肌注HN表达质粒所诱发的抗肿瘤免疫机制。

1材料和方法

1．1材料新城疫病毒Lasota株、大肠杆菌DH5α均为本室保存。B16黑素瘤细胞、YAC-1细胞、COS-7细胞，购自中科院细胞所。质粒 pGEM-T载体，反转录酶、LDH非放射性细胞毒检测试剂盒，购自Promage公司。 pcDNA3为本室保存。C57小鼠，雄性，6～8周龄，购自第二军医大学实验动物中心。限制性内切酶及T4 dNA连接酶均为Boeheringer公司产品。Taq DNA聚合酶为PE公司产品。胶回收试剂盒购自华舜公司。其他试剂均为分析纯。寡核苷酸引物系中科院植物生理研究所合成，引物序列为：P₁5′-GGATCCATGGACCGCGCCGTTAGCCAAG-3′。P₂5′-TCTAGACTAGCCAGACCTGCCTTCTCTA-3′。

1．2方法

1.2.1病毒RNA的提取及RT-PCR合成HN cDNA取血凝效价为1∶2 400的NDV鸡胚尿囊培养液0.5 ml，加入RNA抽提缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA , 0.5% SDS, 用前加入1 mg/ml蛋白酶K）0.5 ml， 37℃作用1 h，酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶ 1抽提，无水乙醇沉淀RNA。 采用一步法进行反转录及扩增HN cDNA。37℃ 1 h反转录、94℃ 5 min预变性后，进入循环反应，条件为94℃1 min，52℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环。

1.2.2HN cDNA的克隆及测序回收大量扩增的长度为1.7 kb的PCR产物，与pGEM-T easy载体连接，酶切鉴定克隆方向，选取正向插入克隆，以SP6，T7及自行合成的两个序列为引物，测定HN cDNA全长序列。

1.2.3HN 真核表达载体pcDNA3-HN的构建及在COS-7细胞中的表达pGEM-HN质粒经BamHⅠ，Xba Ⅰ双酶切后插入真核表达载体pcDNA3中同样的酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，筛选克隆后酶切鉴定。用电穿孔的方法将pcDNA3-HN转入COS-7细胞（穿孔条件电容为960μF，电压为250 V），pcDNA3-HN 40 μg，COS-7细胞密度为1×10⁷/ml。培养12 h后换液1次，48，72 h收取上清。同时设阴性对照，质粒为空载体pcDNA3，穿孔条件与上相同。血凝试验及血凝抑制试验检测表达产物及表达量。

1.2.4动物实验及分组将C57小鼠随机分为4 组，每组10 只。1组：荷瘤前后3 d各注射pcDNA3-HN 1次。2组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3-HN 1次。3组：荷瘤后3,7 d各注射pcDNA3空载体1次。4组：未荷瘤正常小鼠。注射质粒方法：在小鼠左腿外侧肌肉预先注射25%高渗蔗糖，10 min后在相同部位注射100 μg质粒。荷瘤方法：胰酶消化对数生长期B16细胞, 调节浓度为1×10⁶个/ml,每只小鼠背部皮下注射0.2 ml。

1.2.5小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组的NK细胞、CTL细胞活性。小鼠荷瘤20 d处死，每组5只，取脾脏，分离脾单个核细胞，制备细胞悬液(1×10⁷个/ml)。将细胞分为两组，其一以YAC-1细胞为靶细胞，检测NK细胞活性。其二，首先以丝裂霉素C处理(50μg/ml )的B16细胞及ConA(5 μg/ml )诱导，72 h后再以对数生长期B16细胞为靶细胞检测CTL活性。效靶细胞比例(E/T)均为50∶1，100∶1，效靶细胞共同孵育37℃5% CO₂ 4 h，取上清，按试剂盒说明加入LDH作用底物，30 min后终止反应，490 nm处读取D值，计算NK细胞，CTL细胞杀伤活性，计算公式如下：

杀伤活性(%)=［（实验孔D值-自然释放孔D值)／（最大释放孔D值-自然释放孔D值）］×100%

1．2.6统计学处理采用配对资料t检验。

2结果

2．1NDV HN基因的获取及pcDNA3-HN的构建本实验以表达NDV HN蛋白为目的，故所设计的PCR引物包括了翻译起始密码及终止密码，并在5′-端分别引入BamHⅠ，Xba Ⅰ酶切位点，以抽提的病毒RNA为模板，进行RT-PCR，获得了大小为1.7 kb 的PCR产物(图1)。将其克隆至测序载体pGEM-T easy，自动测序仪测序，其序列与GeneBank上登录的一致。用BamHⅠ，Xba Ⅰ酶切pGEM-HN，回收1.7 kb片段，与pcDNA3载体上的相同酶切位点定向连接，经酶切鉴定，获得HN基因的真核表达重组质粒pcDNA3-HN(图2)。

图 1RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳

1： λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker; 2： RT-PCR products;

3： Purification of RT-PCR products

图 2pcDNA3-HN的酶切鉴定

fig 2Enzyme digestion of pcDNA3-HN

1: λDNA Hind Ⅲ/EcoRⅠ marker； 2,4： pcDNA3-HN;

3,5： Enzyme digestion of pcDNA3-HN

2．2pcDNA3-HN转染COS-7细胞、血凝试验检测表达情况收集电穿孔转入质粒后48，72 h细胞培养上清，血凝试验检测,效价分别为1∶8及1∶32，用NDV多克隆抗体可以抑制此凝集反应，而转染pcDNA3对照细胞上清，血凝试验效价为0，表明pcDNA3-HN可表达其所编码的蛋白。

2．3pcDNA3-HN对荷瘤小鼠皮下肿瘤生长的影响小鼠荷瘤后约7 d，第3组小鼠皮下均可触及大小为100～300 mm²的结节，1组及2组只有个别小鼠可触及，用游标卡尺隔日测量瘤体大小显示：1组、2组小鼠肿瘤生长明显慢于3组(P＜0.05，图3)

图 3pcDNA3-HN治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤生长曲线

fig 3Growth curve of subcutaneous tumor in tumor

bearing mice after therapy with pcDNA3-NH○: Only tumor-bearing control;□: Tumor-bearing after pcDNA3-NH injected;△: Tumor-bearing meanwhile pcDNA3-HN injected

2．4小鼠脾细胞NK及CTL活性与正常小鼠(4组)相比，荷瘤后未治疗小鼠(3组)NK活性明显下降，而注射pcDNA3-HN组NK活性有不同程度的升高，尤其第1组，NK活性达到与正常小鼠相近的水平（图4）。统计学处理，1组与2，3组相比具有显著性差异（P＜0.01）。CTL活性也以1组升高明显(P＜0.01)，2组与3组间未见明显差异，4组CTL活性几乎为零（图5）。

图 4NK细胞活性

fig 4NK cell activity□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1

e/T： effector/target; ^ P＜0.01 vs group 2 and 3

图 5CTL细胞活性

fig 5CTL cell activity□： E/T=50∶1； ■： E/T=100∶1

e/T: Effector/target; ^ P＜0.01 vs group 3

3讨论

NDV是一种禽类单链RNA病毒，其RNA长度为15 kb，有 6个编码基因(3′-NP-P-M-F-HN-L-5′)。HN基因编码一相对分子质量为7.4×10⁴的糖蛋白，表达在病毒包膜上,具有凝集红细胞及神经氨酸酶的活性,是NDV与宿主细胞表面的受体结合,继而进入细胞的关键因素,也是NDV的主要免疫成分。NDV对人体无感染性及毒副作用，七八十年代曾作为干扰素诱生剂被广泛应用^［6］。近20年来，ND