国外医学遗传学分册2000年第23卷第3期

邱广斌（综述） 孙开来（审校）

摘要：端粒酶是一种核糖蛋白，包括人端粒酶RNA、端粒酶催化蛋白亚单位三个主要组成部分，可向染色体开端添加端粒DNA序列。端粒酶在85%～95%的恶性肿瘤组织中有阳性表达，而正常体细胞则一般阴性，是进行肿瘤基因治疗的理想靶点。目前以抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究较多，其主要策略有：①阻断人端粒酶RNA的模板作用；②抑制端酶催化蛋白亚单位；③核苷类似物竞争性性抑制反转录过程；④细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性；⑤对细胞内调节机制进行调控；⑥其它抑制剂对端粒酶活性的调节。

关键词：端粒酶肿瘤治疗

端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质构成，在稳定染色体、防止染色体末端融合、保护染色体结构基因等方面发挥着重要作用。人的端粒DNA序列由长约5～15kb的（TTAGGG）n的串联重复片段组成。在正常细胞分裂过程中由于末端复制问题，端粒逐渐缩短，最终导致细胞衰老、死亡，而大多数肿瘤细胞则能通过表达端粒酶维持其端粒长度稳定，从而绕过衰老和危机两个死亡期而无限增殖。端粒酶是一种核糖蛋白酶，有三个主要组成部分，即人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein,TP1/TLP1)和人端粒酶催化蛋白亚单位（the catalytic protein subunit of telomerase,hTERT）。该酶具有逆转录酶活性，能以hTR为模板，向染色体末端添加TTAGGG序列。现有研究表明端粒酶在85%～95%的亚性肿瘤组织中有阳性表达^[1]，而正常体细胞则一般为阴性，端粒酶激活可能是细胞癌变或永生化的一个共同通路。因此，端粒酶激活性为靶点。目前以抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究较多，其主要策略有：①阻断人端粒酶RNA的模板作用；②抑制端粒酶催化蛋白亚单位；③核苷类似物竞争性抑制的反转录过程；④细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性；⑤对细胞内调节机制进行调控；⑥其它抑制剂对端粒酶活性的调节，现综述如下。

1 阻断端粒酶RNA的模板作用抑制端粒酶活性

端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列的，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的。

1.1反义核苷酸封闭hTR

端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成。Feng等首先用含反义hTR的质粒转染HeLa细胞^[2]经过23～26倍增时间后，HeLa细胞进入生长危机并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。为了提高抗核酸降解和进入组织细胞的能力，Piytts等设计了一种甲基化的反义RNA（2’-O-methyl-RNA）^[3]，用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97%。还有学者发现^[4]，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，诱导细胞凋亡。

1.2反义肽核酸封闭hTR

肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子，与核酸分子的不同之处在于将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架由酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨基连接。PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性。由于其不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有较DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力。Norton等设计了肽骨架结构单位为N-（2-氨乙基）-甘氨酸、针对hTR模板区的不同长度的PNA^[5]，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强。PNA的高度亲和性、高度特异性抗降解能力，使之成为极其潜力的肿瘤治疗新药。

1.3 锤头状核酶切割hTR序列

核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，可序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能。Wan等合成了一种甲基化修饰的锤头状核酶（2’-O-methyl-modified hammerhead ribozymes）^[6]，具特异性切割hTR模板区序列的功能。将该酶与人神经胶质瘤U87-MG细胞系的细胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明显抑制，这种抑制作用存在剂量依赖效应。Yokoyama等设计了针对人端粒酶RNA模板区的锤头状核酶^[7]_，能有效切割非细胞体系中的RNA底物，将其导入子宫内膜癌细胞后，可明显抑制端粒酶活性。以上研究表明，这可能是一条有效的治疗肿瘤的新途径。

2 抑制端粒酶催化蛋白亚单位

Horikawa等发现将正常人3号染色体导入人肾癌细胞系RCC23^[8]，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的进行性缩短和细胞的老化，并且证实端粒酶活性的抑制是由于编码hTERT的基因的下调引起的，提示3号染色体上存在直接或间接控制hTERT基因表达的基因。最近大量研究表明端粒酶三个主要组成成分中hTERT与肿瘤的关系最密切^[9，10]，已有学者成功将其克隆^[11]。可以预见，hTERT将会成为肿瘤基因治疗的新的理想靶点。

3 核苷类似物竞争性抑制反转录过程

端粒酶具有反转录酶活性，在催化合成端粒DNA的过程中，需要有4种三磷单核苷酸的参与，故利用一些核苷类似物可竞争性抑制反转录过程，最终达到抑制端粒酶活性和阻止端粒延长的目的。Strahl等对多种核苷三磷酸类似物进行了研究，发现又脱氧鸟嘌呤核苷（dideoxyguanosine,ddG）可造成永生化的人淋巴细胞株JY616和Jurkat e6-1的端粒进行性缩短和端粒酶的明显抑制^[12]，而且ddGTP也有类似的抑制作用。Melana等在培养基中加入叠氮脱氧胸苷（3’-azido-3'-deoxythymidine,AZT）^[13]，发现四种乳腺癌细胞系和T4白血病细胞都出现生长抑制和端粒酶活性的抑制，但不同细胞系所需剂量不同。

4 细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性

分化不良的恶性肿瘤细胞端粒酶活性一般很高，但终末分化的正常人体细胞却无端粒酶活性表达，这提示细胞分化与端粒酶活性之间存在某种关系。Bestilny等的研究发现^[14]，维甲酸（RA）、二甲亚砜（DMSO）和TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）在诱导HL60白血病细胞等永生化细胞终末分化时，可明显抑制细胞端粒酶活性，并使凋亡细胞增多。但这些诱导剂本身并不能直接抑制端粒酶活性，提示端粒酶活性的下调是细胞分化所造成的。Sharma等将DMSO作用于Brukitt淋巴瘤Raji细胞系^[15]，发现其产生可逆性G₀/G₁停滞，并有端粒酶活性的抑制。国内杨骅等也分别用维甲酸和苦参碱间接抑制了大肠癌细胞和红白血病细胞株K562的端粒酶活性^[16，17]。这种抑制作用的机制目前尚不清楚。

5 对细胞内调节机制进行调控抑制端粒酶活性

目前的研究表明，端粒酶活性受多种细胞内机制的调节，故对这些调节机制进行调控也能有效地抑制端粒酶活性。Fujimoto等将与c-cmyc原癌基因mRNA互补的反义寡核苷酸作用于三种人白血病细胞系HL60、U937和K562细胞^[18]，发现三种细胞端粒酶活性都有明显下调。Mandal等的研究发现^[19]，在白介素-2依赖的细胞毒T细胞系CTLL-2细胞中，下调凋亡相关基因Bcl-2的表达可引起端粒酶活性的抑制，而Bcl-2的过度表达则可引起肿瘤细胞端粒酶活性的明显升高。

6 其它抑制剂对端粒酶活性的调节

端粒酶活性也受其它一些抑制剂的调节，如蛋白激酶抑制剂和DNA交联剂。Stao等发现用高浓度生物碱9-HE（9-hydroxyellipticine）^[20]，一种蛋白激酶抑制剂，可快速、完全地抑制端粒酶活性，提示端粒酶蛋白亚基的磷酸化及脱磷酸化及脱磷酸化可能参与端粒酶活性的调节。最近Li等证实人端粒酶蛋白组分hTP1和hTERT都是磷酸蛋白^[21]，其磷酸化是人乳腺癌细胞端粒酶活化的必要条件。Kang等也证实hTERT是激酶Akt的底物蛋白^[22]，hTERT肽链的磷酸化可引起端粒酶活性的上调。以上研究表明蛋白激酶抑制剂可有效阻断端粒酶蛋白的磷酸化，从而抑制端粒酶活性。另外，Burger等发现DNA交联剂顺式（cisplatin)可以抑制人睾丸癌细胞端粒酶活性^[23]，且这种抑制作用有浓度依赖性。Ishibashi的研究也得到类似结果^[24]，并发现较高剂量的顺式铂氨对端粒酶活性的抑制可能是由于TTAGG重复序列的交联，也可能是顺式铂由于氨作用于酶蛋白成分所必须的巯基基团。

综上所述，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗研究已取得了一系列可喜的成果，反义核苷酸、肽核酸、核酶、细胞分化诱导剂等作为端粒酶抑制剂正显示出良好的应用前景，而且这方面的研究还在不断深入。但是，端粒酶抑制剂要作为一种肿瘤治疗药物应用于临床，还不许多问题需要解决。第一，端粒酶活性调节的确切机制还不清楚，不同的抑制剂对同一种细胞或同一种抑制剂对不同的细胞的抑制作用都不相同，如何针对不同的肿瘤选择最有效的抑制剂，还需要进一步研究。第二，除恶性肿瘤细胞有端粒酶活性的表达外，正常人类生殖细胞、造血干细胞、外周血白细胞、表皮细胞等具有再生能力的细胞也有不同水平的端粒酶活性表达，所以端粒酶抑制剂的毒性评价也是一个非常重要的问题^[25]。第三，迄<