国外医学肿瘤学分册2000年6月第27卷第3期

中国医学科学院 血液学研究所 (天津 300020) 王勇（综述）吴克复（审校)

中国协和医科大学

摘要肿瘤细胞能表达肿瘤相关抗原(TAA)。TAA基因的克隆与鉴定为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。肿瘤基因疫苗以TAA为攻击靶点，诱导机体产生TAA特异性抗肿瘤免疫，能够刺激宿主产生TAA特异性抗体和能溶解肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞，并获得对相应肿瘤的免疫保护能力。接种肿瘤基因疫苗的小鼠能够排斥同种移植瘤的形成，延长荷瘤小鼠的生存期。

关键词：肿瘤基因疫苗免疫治疗肿瘤相关抗原

基因疫苗也称DNA疫苗或基因免疫，是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，再用该质粒DNA免疫动物。抗原编码基因能够在宿主体内表达。并刺激产生体液免疫和细胞免疫应答^[1]。基因疫苗是由wolff等^[2]在研究体内基因转染时意外发现的，对照组裸露的质粒DNA比实验组用脂质体包装的质粒DNA更容易转染；裸露的质粒DNS肌注后可以直接转染肌细胞，并表达其携带的报告基因。Tang等^[3]首先证明DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗人生长激素和α-1胰蛋白酶的抗体。目前，包括艾滋病DNA疫苗在内的一些基因疫苗已经进入Ⅰ～Ⅱ期临床试验^[1.4]。

肿瘤相关抗原（TAA）不仅作为肿瘤标志物与肿瘤特异性的抗体结合用于免疫检测与诊断，而且也是抗肿瘤免疫攻击的靶点^[5]。肿瘤抗原基因的克隆与鉴定，为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。基因疫苗的突出优点是能通过不同途径诱导产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）。由于CTL反应对控制病毒感染和抗肿瘤免疫起着重要作用。因此基因疫苗在诱导抗肿瘤免疫方面比常规疫苗更具有优势。

一、基因疫苗的构建

组成基因疫苗的两大要素是目的基因和表达载体。目的基因一般指编码抗原的cDNA序列，要求该基因片段能在哺乳动物细胞中表达；载体主要用质粒，因质粒可用大肠杆菌大量生产，但不会在哺乳细胞中复制整合。常用的有pSV2、pRSV、pcDNA3.1和pCI等质粒。基因疫苗的构建是在细菌质粒上引入一个真核启动子，如人巨细胞病毒早期启动子（CMV-IE），在启动子的下游克隆进感兴趣的目的基因，其后接上PolyA和转录终止序列。简言之，在真核表达质粒上克隆进某抗原基因的cDNA序列，即构成了DNA疫苗或基因疫苗。由于质粒上不仅有大肠杆菌的复制起点，而且有真核启动子，所以基因疫苗既能在大肠杆菌中复制，又能在真核细胞表达。质粒经细菌扩增，再提取和纯化后溶于生理盐水溶液就可直接用于免疫接种^[1-4]。

二、基因疫苗的免疫机制

DNA疫苗能够有效地将其编码的抗原提呈给免疫系统，诱导广泛的免疫应答，包括诱导产生抗体、MHC-Ⅰ限制性CD8⁺的CTL和MHC-Ⅱ限制性的Th。

（一）基因疫苗的抗原递呈

质粒DNA注射到肌肉组织后，最容易被转染的是肌细胞。宿主肌细胞通过胞饮方式摄取外源性DNA。质粒编码的抗原基因在肌细胞内首先转录成mRNA，再翻译成抗原蛋白，经加工处理后，抗原分子与肌细胞表达的MHC-Ⅰ类抗原形成复合物，并将抗原递呈给CD8⁺细胞，诱导产生细胞免疫反应。Ulmer等^[6]报道用流感病毒核蛋白（NP）基因转染C2C12肌肉细胞系，再将该细胞移植给C3H小鼠，尽管NP的表达仅局限于肌肉细胞，但还是检测到了NP特异性CTL的产生，提示在肌细胞表达的抗原能够诱导产生细胞免疫应答。

由于肌细胞不是专职的抗原递呈细胞（APC），细胞表面无MHC-Ⅱ类抗原，也不表达B7等共刺激因子，因此单独由肌细胞递呈抗原是不够的，基因疫苗的抗原递呈机制中应包括单核-巨噬细胞在内的APC的作用，巨噬细胞可以吞噬受损伤的肌肉组织，并表达外源基因编码的抗原蛋白。转染的肌细胞释放表达的外来抗原，被巨噬细胞摄取，经加工后再提呈给Tc。或通过Th提呈给B细胞，诱导细胞与体液免疫^[1，5]，肌肉组织中丰富的树突状细胞（dendritic cell ,DC）能表达MHC-Ⅱ和B7分子，是专职的APC。基因疫苗所编码的抗原是如何被DC递呈给VD4⁺细胞，并有效地诱导体液免疫的，目前尚不清楚。基因疫苗可能通过如下途径递呈抗原：①直接通过转染的肌细胞介导和递呈抗原；②专职的APC（如DC等细胞）被质粒DNA转染而表达和递呈抗原；③转染的肌细胞将表达的外来抗原转移给APC。

尽管DNA疫苗最早是通过肌肉注射而获得有效免疫的，是使用最多、最方便的一种免疫方式，但是其它免疫途径，如皮下注射、皮内注射、静脉注射、基因枪轰击和鼻粘膜滴注等，均能获得有效的免疫应答。基因枪轰击可以直接转染皮肤的DC，被认为是目前最好的接种途径。

（二）基因疫苗的优越性

肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。基因疫苗具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。DNA疫苗的另一优势是可将多个抗原表位基因克隆同一表达载体，制备多表位DNA疫苗（多价疫苗），诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫^[7]。与病毒载体相比，质粒载体既不会引起抗质粒的免疫反应，也没有潜在的致病危险性。质粒DNA可长期存在于接种部位的组织细胞内，模拟自然感染过程，长期表达抗原蛋白（但不存在减毒活疫苗的毒力回复等危险），持续刺激免疫系统，能够诱导产生强大而持久的免疫应答。DNA疫苗所表达的内源性抗原，有利于MHC-Ⅰ类分子的抗原呈递，有利于诱导CTL的产生，从而更有效的诱导抗肿瘤免疫反应。

三、提高肿瘤疫苗的免疫效率

共刺激因子（costimulatory factors）是T细胞激活的第二信号。TCR与抗原结合产生T细胞活化的第一信号（初级信号），而T细胞表面的的CD28与APC表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被完全活化，如果只有TCR介导的第一信号，缺乏B7等共刺激因子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫无反应性（免疫耐受）。作B细胞淋巴瘤和部分黑色素瘤外，肿瘤细胞不表达B7.1(CD80)或B7.2(CD86)分子,因此肿瘤细胞容易导致免疫耐受。

（一）转基因瘤苗

采用转基因手段用某些功能基因修饰肿瘤细胞，能提高瘤苗的免疫原性或激活效应细胞的功能，诱导产生保护性抗肿瘤免疫。为了提高肿瘤疫苗的免疫效率，主要采取的措施有：①共刺激因子和粘附分子基因修饰的瘤苗，能提供T细胞活化的第二信号，打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受状态^[5]；②用肿瘤细胞冲击DC或者用TAA基因转染DC，制备DC细胞疫苗，这种DC细胞既能将TAA提呈给免疫细胞，又能提供B7等共刺激因子，因此能够更有效地诱导抗肿瘤免疫反应^[8.9]；③用GM-CSF或lL-12等细胞因子基因转染自体瘤细胞,以增强瘤苗的免疫反应性。最近，应用转染了GM-CSF或IL-12等基因的自体瘤苗治疗晚期黑色素瘤的计划，已进入早期临床试验阶段^[10]。

（二）基因疫苗的“免疫佐剂”

GM-CSF、lL-12或IL-15等细胞因子可以大大增强基因疫苗的免疫效率，共同注射DNA疫苗和细胞因子的表达质粒，其诱导产生免疫反应的效率高于单独用基因疫苗组^[11]。疫苗注射局部产生高浓度的GM-CSF，其能够刺激DC的迁移，促进DC的增殖与成熟，增加DC对抗原的摄取，以促进产生免疫应答。IL-12激活CTL并诱导强大的抗肿瘤反应，因此认为这些细胞因子对基因疫苗具有“免疫佐剂”的作用^[12]。

四、基因疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫反应

肿瘤基因疫苗能诱导肿瘤细胞特异性的CTL和TAA特异性的抗体产生，使宿主获得保护性的抗肿瘤免疫。

（一）黑色素瘤

黑色素瘤的化疗效果很差，有效率低于25%，而黑色素瘤的免疫治疗开展较早，取得的经验也较丰富。动物实验证实无论是重组蛋白疫苗，还是DNA疫苗都获得了抗肿瘤免疫反应^[5]。研究表明，黑色素瘤抗原MAGE-3的单表位疫苗能够刺激产生黑色素瘤特异性的CTL，并导致肿瘤的消失。黑色素瘤及其转移瘤的抗原表达变异很大，如36%的原位黑色素瘤和76%的转移瘤表达MAGE-3抗原；另外有大约50%的黑色素瘤表达酪氨酸激酶。因此，单表位的DNA疫苗难以对付黑色素瘤抗原的高度变异性，多表位DNA疫苗可以攻击黑色素瘤的多个靶抗原，以防止黑色素瘤因肿瘤抗原表达的差异而逃避免疫攻击^[7]。

（二）独特型DNA疫苗

多数B细胞淋巴瘤具有单一B细胞克隆性增殖的特性，其特异性的B细胞受体，即独特型表面免疫球蛋白，不仅是B淋巴瘤的标志物，同时也是特异性的肿瘤抗原，可以诱导免疫应答，成为免疫系统攻击的靶点。实验证明独特型表面免疫球蛋白分子和独特型DNA疫苗都能够诱导抗独特型抗体（anti-Id）的产生，保护小鼠免遭移植瘤的攻击^[13]。应用编码有Id和GM-CSf融合蛋白的DNA疫苗，证明GM-CSF能够提高独特型DNA疫苗的免疫效率，使免疫小鼠