国外医学肿瘤学分册2000年6月第27卷第3期

上海医科大学中山医院肝癌研究所（上海200032）崔健（综述）周信达刘银坤（审校）

摘要Wnt通路是诸多细胞信号传导系统中首先被阐明作用机制的。本文从Wnt通路的组成及结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌等人实体肿瘤中Wnt通路各成分的变化等方面综述异常Wnt通路的最新研究成果。

关键词：Wnt信号β-cateninAPC蛋白

Wnt基因于1982年发现于小鼠乳腺癌，其最初被命名为Int-1（来源于insert，因为此基因激活有赖于小鼠乳腺癌相关病毒基因的插入），并被认为是癌基因。但随后的研究表明，Int-1基因在小鼠正常胚胎的发育中起重要作用，相当于果蝇的无翅（wingless）基因，其编码蛋白在细胞间有传递生长和发育信息功能，可控制胚胎轴向正常发育^[1]。此后大量研究均提示了Int基因在胚胎期神经系统发育中的重要性，因此将wingless与Int-1结合，提出了Wnt基因的称谓^[1]。人Wnt基因定位于12q13。在胚胎发育中，Wnt基因调控的重要信号传导系统即为Wnt通路。

近年研究已否认了正常Wnt基因的致癌性，但是研究发现，在细胞癌变过程中，Wnt通路异常变化可能起重要作用，这种变化可由Wnt基因本身或通路任何成分发生改变而引发。

一、Wnt通路组成

目前研究表明，细胞内Wnt通路主要由以下几种蛋白构成：β-连接蛋白（β-catenin）、APC蛋白（adenomatous polyposis coli）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）及轴蛋白或传导蛋白（axin or conductin）。β-catenin是Wnt通路的正向调节因素，而APC蛋白、GSK-3β及axin等是负向调节因素^[2，3]。正常胚胎发育中，Wnt蛋白与细胞膜上相应受体结合后，通过一种目前命名为disheveled的蛋白使GSK-3β失活，保证胞浆内β-catenin不被GSK-3β降解。β-catenin进入细胞核与转录子结合，启动转录过程，调控相应基因表达。正常成熟细胞中没有Wnt信号，胞浆内的β-catenin大部分与细胞膜上的钙粘蛋白（E-cadherin）结合，少部分与胞浆内APC蛋白、GSK-3β及轴蛋白结合，三者结合形成复合体后，GSK-3β通过磷酸化可降解β-catenin，因而胞浆内游离β-catenin水平极低，不能进入细胞核调控相应基因表达。在肿瘤细胞中存在异常Wnt通路，其激活既可能由通路中各成分包括β-catenin、APC蛋白、GSK-3β及轴蛋白突变所致，也可能是Wnt基因本身突变。Wnt通路终点是β-catenin与T细胞转录子Tcf结合而激活相关转录过程。已有研究表明，在正常细胞中导入外源性Wnt信号或突变的β-catenin基因，可导致β-catenin-Tcf复合体形成，细胞转录活性大大提高^[4]。而β-catenin与Tcf结合后，也确可导致正常细胞癌变^[5]。异常Wnt通路致癌关键是胞浆内游离的变异β-catenin蛋白积累并进入细胞核。Kinzler等应用基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）筛选了多种癌基因后，发现c-myc基因可能是核内受异常Wnt通路调控的最重要的癌基因之一^[2]。

β-catenin基因定位于人染色体的3p2.1，由16个外显子组成。其中外显子3的第33、37、41、45位密码子编码区域构成的β-catenin蛋白的NH2未端是GSK-3β结合位点，其缺失或突变会导致β-catenin不与GSK-3β结合而免于降解，并在胞浆内积累^[6]。

APC抑癌基因定位于人染色体5p21-22，长度约10.4kb。其突变在“家族性腺瘤样息肉病”（FAP）的发生和癌变中起重要作用^[7]，在多种散发性肿瘤包括大肠癌、胃癌、食管癌中也可频繁检测到其突变或缺失。APC基因突变可发生于任何外显子，但以第15外显子（654～2843密码子）最为常见。其中1020～1169密码子及1323～2075密码子编码区域被认为是β-catenin与APC结合并被降解所需^[8，9]。

GSK-3β虽作为Wnt通路的一个成分被认为具有降解胞浆内游离β-catenin功能，但一直未能发现其与β-catenin直接作用的证据。最近研究表明，GSK-3β是通过APC蛋白发挥作用。GSK-3β使APC蛋白磷酸化，而磷酸化后的APC蛋白具有了与β-catenin的高亲和性，进一步降解β-catenin^[10]。此外，近来还有研究表明，GSK-3β本身通过磷酸化也能起到降解β-catenin作用，其磷酸化位点的突变也能导致胞浆内β-catenin含量增加^[11]。

二、Wnt通路与肿瘤发生

已有多份研究报告在乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、内皮样卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、原发性肝癌、甲状腺癌中均有Wnt通路异常。乳腺癌的Wnt通路异常通常与Wnt本身基因突变有关，而其他肿瘤发生则多与通路中各种成分变化有关。Morin等^[8]检测了APC基因正常的4例结肠癌细胞株及5例结肠癌标本中β-catenin基因突变，发现4株细胞系在蛋白印迹时均表现出正常野生蛋白信号，但β-catenin基因序列分析结果显示有2株细胞存在突变，其中1例为β-catenin基因45密码子缺失，另外1例为33密码子点突变。5例肿瘤标本中有3例检测到β-catenin基因突变存在，所有突变均集中在外显子3所编码的GSK-3β结合磷酸化位点。同时还应用PCR直接测序更加详细地分析了Wnt通路各成分在结直肠癌临床标本中的突变，发现在APC基因完整的结直肠癌中β-catenin基因外显子3的突变率高达50%。而且在2例结肠腺瘤（其中1例直径＜6mm）中检测到β-catenin基因突变。在28例存在APC基因突变标本中，无一例检测到β-catenin基因外显子3突变，而同时检测的γ-catenin基因、GSK-3α与GSK-3β基因也均未检测到突变^[12]。这是到目前为止有关人实体肿瘤中异常Wnt通路研究最为详细的文献报道，结果有力提示β-catenin不但可能是结直肠癌发生早期事件之一，而且是细胞癌变过程中起着与APC基因同样举足轻重的作用。另外，在实验性毒物诱导的大鼠结肠癌研究中也得到类似的研究结果^[13]。Brabletz等^[14]的研究不但发现结肠癌标本中存在β-catenin表达异常（即在胞浆及胞核内异常积聚），而且发现这些细胞多集中在实体瘤边缘浸润性较强的部分，而肿瘤中心的癌细胞则多无核内β-catenin积累，提示Wnt通路异常与肿瘤侵袭能力有一定关系。Samowitz等^[15]的研究发现却表明在结肠小腺瘤（＜1cm）、大腺瘤（≥cm）、侵袭性结肠癌中β-catenin基因外显子的显著差异，提示β-catenin基因突变可能是结肠癌发生过程中的早期事件。

对黑色素瘤的研究也显示了类似结果。27株黑色素瘤细胞中有6株存在β-catenin基因外显子3突变，在另外20株β-catenin基因完整的细胞株中可检测到APC基因突变存在，而且无论β-catenin基因还是APC基因，对Wnt通路的调控均是独立的，都单独通过改变细胞浆中游离的β-catenin水平来完成^[16]。Rimm等^[17]对黑色素瘤标本的研究进一步证实了以上观点，应用免疫组化和DNA直接测序研究了65例黑色素瘤标本后，发现大约三分之一的标本有Wnt通路异常（表现为β-catenin在细胞内异常分布），但只有1例标本检测到β-catenin基因外显子3突变，提示黑色素瘤中还有另外独立因素（很可能是APC基因突变）调控Wnt通路。

对其他实体肿瘤中异常Wnt通路的研究主要在β-catenin基因突变及蛋白表达。Coste等对人及转基因小鼠原发性肝癌研究后发现，肝癌细胞中广泛存在着β-catenin基因外显子3点突变，应用Wester blot发现60%肿瘤标本中有异常β-catenin蛋白表达。而且同一肿瘤结节可表达出不同条带，提示肝癌发病的多克隆性。他们同时应用免疫荧光检测了4株肝癌细胞中β-catenin蛋白表达，发现2株有β-catenin突变，存在β-catenin蛋白胞浆及细胞核内异常积聚现象。应用RT-PCR和变性梯度胶电泳结果显示，26%（8/31）的人肝癌标本及50%的小鼠肿瘤标本均存在于外显子3的33、37、41、45密码子突变^[18]。这些密码子编码区域正是GSK-3β结合并降解β-catenin所必需。Koch等^[19]应用RT-PCR-SSCP及DNA直接测序研究了52份儿童肝母细胞瘤的β-catenin基因及APC基因突变后发现，所有标本中未能检测到APC基因突变热点区的变异，而β-catenin基因的突变率却达到了48%。突变方式有外显子3的有意点突变、大段碱基缺失，长度从24bp到507bp不等，部分突变还涉及到外显子4。在来源于肝母细胞瘤的细胞株HepG2中还检测到涉及外显子3及4的长达548bp的碱基缺失，Wester blot分析表明在肝母细胞瘤中存在变异β-catenin蛋白表达，免疫组化显示β-catenin蛋白主要分布于胞浆及细胞核内。以上结果提示在肝母细胞瘤发生中，异常Wnt通路可能起到极其重要作用。而Miyoshi等^[20]的研究表明，在人原发性肝癌中，β-catenin基因突变率为14.7%，突变方式12例为外显子3的第32、33、34、41或45密码子点突变，2例为外显子3的部分碱基片段缺失。Voeller等^[21]应用PCR-SSCP和DNA直接测序检测了104例前例腺癌标本及4株前列腺癌细胞株中β-catenin基因突变。结果表明，前列腺癌标本中β-catenin基因突变率仅为4.8%(5/104),其中4例突变发生在编码GSK-3β结合区的第33、41、45密码子，1例突变发生在高度保守的第32密码子。4株前列腺癌细胞株中未检测到突变，提示β-catenin突变所致的Wnt通路异常在前列腺癌发生中的作用可能不如在结直肠癌及黑色素瘤大。Pala-cios等^[22]应用免疫组化及PCR产物直接测序检测了40例内皮样卵巢癌中β-catenin基因外显子3的突变及蛋白表达，发现在肿瘤中存在β-catenin蛋白的胞浆内积聚和再分布的现象。正常情况下，β-catenin只表达于细胞膜，<