国外医学肿瘤学分册2000年6月第27卷第3期

空军总医院空军临床分子生物学研究中心（北京100036）燕东亮（综述）刘丽（审校）

摘要TNF具有较强的抗肿瘤作用，但某些高表达TNFR的肿瘤细胞对其仍有抗性。核转录因子κB（NF-κB）与肿瘤细胞抵抗凋亡有关，TNF与肿瘤表面的TNFR结合后可激活NF-κB，反过来，NF-κB又可抑制TNF对肿瘤细胞的细胞毒作用。众多的研究提示，抑制NF-κB能够增强TNF抗肿瘤作用。本文对这方面的有关研究作一综述。

关键词： NF-κBTNF

TNF的抗瘤效应具有非种属特异性和非时相特异性。受体（TNFR）介导的TNF识别机制是TNF引起细胞毒性所必需的。TNFα-TNFR1特异性结合后促进细胞凋亡，但利用重组TNFα蛋白或导入TNFα基因、TNFR1基因治疗肿瘤时却发现，尽管肿瘤细胞表面并不缺乏TNFR，但仍对TNF诱导的凋亡具有抵抗作用^[1]，提示TNF与TNFR作用可以引发细胞内效果不同的信号传导途径。新近研究发现，NF-κB在TNF诱导肿瘤细胞凋亡的同时也被激活，并对凋亡具有抑制作用^[2-4]。抑制NF-κB以增强TNF诱导肿瘤细胞调亡成为TNF基因治疗的研究热点。

一、TNF激活NF-κB

（一）NF-κB的生物学特性

核转录因子是一类蛋白质，具有和某些基因上启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能。NF-κB最初是从B细胞的核抽提物中发现的一种能与免疫球蛋白κ链基因的增强子，κB序列（GGGACTTTCC）特异性结合的核蛋白因子，所以称为NF-κB，它能与κ序列特异性结合后促进κ轻链的表达。NF-κB是ReL蛋白家族成员，NF-κB/BeL家族成员共有C-ReL、NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)、RelA(P65)、ReLB。这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基未端，称为ReL同源区RHD（relhomology domain）或NRD（NF-κB/Rel/dorsal），其中包括DNA结合部位、二聚体化部位及与IκB结合位点-NLS（nuclear translocation signal）。有活性的DNA结合的NF-κB是一个二聚体，标准NF-κB（P50与P65二聚体）结合的序列为5′GGGRNNYYCC3′，而ReLA/CReL二聚体的结合序列为5′HGGARNYYCC3′（其中H代表A、C或T，R为嘌呤，Y为嘧啶）。ReL蛋白成员间可形成同源或异源二聚体，不同的NF-κB/Rel蛋白二聚体具有不同的结合序列，而且具有各自的特性，不同二聚体可识别细微不同的DNA靶目标，从而使NF-κB亚单位对不同调节基因的表达能力得以提高。绝大多数NF-κB蛋白（P50/P65、P50/C-Rel、P65/C-ReL）是转录激活的复合体，但P50同源二聚体和P52同源二聚体则是转录抑制的复合体。研究发现，许多基因的启动子上都有功能性NF-κB的结合位点，具有这些启动子或增强子的基因包括TNF、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF、ICAM-1、MHC-1、TNFβ等^[5]。

（二）TNF激活NF-κB信号传导机制

作为可诱发的转录调节因子，NF-κB结合位点可接受多种免疫刺激，如TNF、IL-1、LPS、T细胞激活剂、生长因子以及病毒感染等均可激活NF-κB^[8]。在非激活条件下，NF-κB在细胞浆内以一种无活性形式存在，即NF-κB与它的抑制蛋白形成复合物，这种抑制蛋白主要为IκB家族。IκB家族成员有IκBα、IκBβ、IκBβγ、IκBδ等，它们拥有5～7个与ReL蛋白相互作用的锚蛋白重复序列和与降解有关的C端PEST序列，IκB掩盖NF-κB的核定位信号，以无活性方式滞留NF-κB于胞浆^[6]。目前以IκBa的研究最为深入，它主要与NF-κB/ReL rHD的氨基酸残基发生作用，而RHD可能含有核易位信号序列（NLS），或者在NLS周围，从而掩盖了NLS，抑制了NF-κB的核易位使之滞留于胞浆。IκBα是NF-κB的主要调控抑制蛋白，主要与含有ReLA和C-ReL的二聚体具有高亲和力，而与其他ReL亲和力低。IκBα、IκBβγ、和IκBδ是ReL蛋白P50和P52的前体P105、P100，其C末端拥有锚蛋白重复序列，可经此与ReL蛋白N末端RHD产生二聚体化存留于胞浆。BcL-3为新发现的一类lκB蛋白，位于细胞核，协同P50或P52同源二聚体发挥转录激活，即BcL-3与特有的NF-κB二聚体相互作用，产生转录活性，而非核易位抑制或DNA结合抑制。与IκBα和NF-κB相互作用相反，BcL-3不能与P50的NLS结合^[7]。包括TNF在内的胞外刺激可通过一个或多个信号转录途径激活蛋白激酶，致胞浆中NF-κB三聚体复合物中IκBa磷酸化而解离。游离的IκBa与遍在蛋白结合发生遍在蛋白化，经蛋白酶小体降解，NF-κB二聚体发生核易位^[5]。

由于几个被NF-κB上调的抗凋亡基因被鉴定出来，使得NF-κB激活机制的研究日趋明朗，它们是TRAF1（TRADD-TNFR-associated factor 1）、TRAF2、c-lAP1(apoptosis inhibitor protein 1）、C-lAP2，这四个基因被认为是NF-κB转录活性的靶位^[8]。这些基因的产物与抵抗TNF介导的凋亡有关。TNFR1信号传导途径有二条^[9]：一是FADD（fas-associated protein with death domain）介导的凋亡，另一是通过TRAF2激活NF-κB抑制凋亡。当TNFα与TNFR1结合时，TRADD（TNFR-associated death domian）可以其死亡域结合TNFR1的胞内死亡域，并直接激活FADD或TRAF2。FADD引导细胞凋亡，TRAF2激活NF-κB抑制凋亡。在肿瘤细胞抵抗TNFα介导的凋亡过程中，这二条途径共存，但为何TRAF2-NF-κB这一途径占优势尚未搞清，推测是TRAF2与FADD竞争TRADD。实际上，对TNFα具有抗性的肿瘤细胞表达的TRAF远高于FADD，少量的NF-κB即很快导致高水平的TRAF2产生，同时由于NF-κB可激活TRAF2的转录，因而经此正反馈作用扩大了TRAF2-NF-κB途径。TNFR1、TRAF2都可以诱导细胞凋亡和NF-κB的活化，TNFR2和CD40均可经TRAF2激活NF-κB^[10]。实验发现存在TNFR1-TRADD-TRAF复合物，而不存在TRAF2-TRADD-TRAF复合物，TNFR1死亡域与TRADD死亡域具有较高的亲和力，并且TNFR1介导的凋亡作用强于TRAF2，推测TNFR2和TRADD竞争TRAF上的同一结合位点^[8]。

Schutze等认为TNFα通过与TNFR1结合激活PC-PLC（PC-specific phospholipase C）,并产生1，2二酰基甘油（1，2DAGs），后者激活两种酶——蛋白激酶C（PKC）和酸性鞘磷脂酶（acidic smase），酸性鞘磷脂酶水解鞘磷脂（SM）产生神经酰胺（ceramide），后者通过尚未明确的途径可快速诱导NF-κB激活，PKC则经另一途径激活NF-κB。目前存在的问题是如何把同TNF受体有关的蛋白与调控NF-κB的信号分子（TRAF2、ceramide）功能性地联系在一起。

NF-κB的反馈调节于细胞内外均可发生，正反馈可以通过细胞外机制扩大刺激信号，NF-κB的激活可以增加TNF、IL-1β等的转录，而后者又可反过来激活NF-κB。对NF-κB的负反馈调节可由于细胞内NF-κB的激活导致IκBα、P105基因的转录上调，因为此二基因上均有NF-κB的作用位点，随着P105的增加，P50二聚体也增加，后者可降低NF-κB介导的效应。因为P50二聚体不能与IκB有效结合，并且缺乏转录激活区域，它们可以通过与其他ReL蛋白竞争NF-κB的结合位点来抑制NF-κB介导的基因表达。负反馈也可由于细胞外刺激（TNF、IL-1）导致反向细胞因子的产生，如IL-10即可通过抑制内毒素介导的NF-κB激活，抑制某些细胞因子的产生^[5]。

二、NF-κB对TNF抗肿瘤的影响

（一）抑制NF-κB提高肿瘤细胞对TNF的敏感性

以往对NF-κB的认识只限制于其在炎症、应激、免疫方面的作用，Beg等^[11]最早发现NF-κB与细胞死亡有关，并发现缺乏NF-κB鼠的肝脏由于肝细胞凋亡而出现退行性变，认为NF-κB与抑制胚胎细胞凋亡有关，因而推想其可以抑制肿瘤细胞凋亡。许多高表达NF-κB的肿瘤细胞表现出对射线、化疗、TNF介导的凋亡的抵抗作用，这些表达NF-κB的肿瘤细胞也能够表达细胞因子。细胞因子的产生、NF-κB含量的增加和对细胞凋亡的抑制是一个相互联系的现象。

以腺病毒为载体转染 IκBα基因联合TNFα处理Jurkat、MEF(mouse embryo fibroblast)细胞株，与单用TNFα处理的对照组作比较，发现凋亡率为44%:4%；67%:8%^[12]。给予大肠腺癌（clon26）移植瘤祼鼠NF-κB decoy发现，可抑制肿瘤导致的恶病质，但对肿瘤生长无影响。Northern blot检测发现IL-6等与导致恶病质有关的细胞因子表达降低，用E2F decoy则可抑制肿瘤生长，因其可抑制细胞增殖基因 c-myc、C-myb、cdc2、PCNA、TK^[13]。当分别用PDTC（pyrrolidine dithiocarbamate）和NF-κB decoy联合TNFα蛋白处理前列腺癌细胞株DU145、PC3时发现，TNFα联合NF-κB decoy处理的细胞凋亡明显增加，TNFα用量可减至20ng/ml,而单一应用TNFα50ng/ml者细胞生长未受到抑制。单纯抑制NF-κB不能直接杀伤肿瘤细胞，联合应用则可以降低TNFα剂量并提高作用效果^[2]。我们将NF-κB抑制剂，即全硫代修饰的双链κB序列（AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC）与PSP94-TNFα dlla基因治疗联合应用，在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行实验，结果与单用PSP94-TNFα dlla基因治疗的对照组比较有显著性差异，前者抑瘤率是后者的1.8倍,但仅用NF-κB抑制剂对肿瘤生长无影响。NF-κB虽然并不直接诱导肿瘤生长进展，但作为转录激活因子对产生这些细胞因子的基因起作用，如实验发现DU145和PC-3可以表达许多细胞因子和细胞粘附分子，诸如IL-6、IL-8、GM-CSF、ICAM-1等，它们可能在维持肿瘤细胞的存活、生长进展中起重要作用。上述结果同时反映了NF-κB激活转录不同的细胞因子产生不同的效应。与此不同的是，应用腺病毒载体转染IκB