中国矫形外科杂志2000年第7卷第3期

于锡欣李孟军

关键词：肿瘤微血管研究方法

肿瘤微血管形成是瘤细胞获得血管生长能力，分泌血管生长因子，诱导毛细血管形成而建立血液循环的过程。当前，关于肿瘤血管生成机制及抗血管生成治疗肿瘤研究已成为研究肿瘤的“热点”。但作为观察肿瘤微血管生成情况和评价抗肿瘤治疗效果的主要手段，测定肿瘤微血管密度和特征的方法虽然取得长足发展，现仍然存在很大争议。

早在1863年，Virchow就注意到恶性肿瘤血管的异常变化，后来肿瘤组织具有丰富血管的观点得到广泛认同，但机制未明。1945年Algire首先提出“肿瘤血管形成(Tumor angiogenesis, neovascularization)”的概念。之后，人们发现恶性肿瘤较良性肿瘤血运更丰富，1971年Folkman将由瘤细胞分泌的能够促进肿瘤血管生长的物质命名为“血管生成因子(Tumor angiogenesis factor, TAF)”，为肿瘤血管生成因子的研究奠定了基础^［1］。

1972年Bapareochi等以血管内皮细胞的3个生物学再生指标对肿瘤的血管形成情况进行平分：血管增生情况血管最高密度区的血管数，内皮细胞学参数，及有丝分裂频率^［2］。该方法是在细胞形态学水平进行观察，由于对内皮细胞无特异染色，不能分新生血管和已存在的血管，难以分辨散在的单个内皮细胞。

1978年，Brem等用肿瘤及正常组织植入兔眼中，进行诱导血管生成实验，发现肿瘤组织诱导血管能力强于正常组织^［3］。但动物接种法观察时间长，难以定量，对照条件不严格，缺乏实用性。肿瘤血管的超微结构观察，应用电子显微镜观察瘤组织微血管形态及内皮细胞的形态结构，可区分正常血管和新生血管^［4］，但是，该方法手序复杂，实验设备及成本要求高，难以普及应用。

用彩色多谱勒及磁共震成像观察肿瘤血管生成定量与病人预后的关系，具有可术前应用，对肿瘤血管生成水平进行评价，无创伤检查的优点^［5］。但敏感性较差，易产生假阳性，缺乏特异性，因而临床价值有限。

免疫组化技术的应用为肿瘤微血管研究开辟了新天地，1988年Srivastara等^［6］首先应用免疫组化法标记血管内皮细胞对肿瘤微血管生成进行评价后，该技术得到迅速推广。应用血管内皮细胞特异性抗体标记微血管，不但可以观察微血管特征，而且可行微血管密度测定，进行量化比较。但如何计数尚存在争议，Weidner最早报告的方法是，在微血管密度最大区，取多个200倍视野的微血管记数的均数作为该病人的微血管密度^［7］，这一方法为多数人所接受。但是，人们在对癌症标本的研究中发现，在瘤组织中存在血管密集区，即所谓“热点”，并认为该区血管密度最大值代表肿瘤血管生成能力，最近的许多研究都采用了在微血管密度最高区用1个200倍视野的微血管数作为研究病人的微血管密度^{［9，10，12］}。众所周知，肿瘤内部血管分布是不均匀的，在不同切片其微血管分布可不同，任何一点的血管密度难以代表整个肿瘤，取一个最高密度值的方法，更易加大测定值与实际值的偏差，采用免疫组化法研究微血管密度，发现血管分布呈现非均匀性，采用取最大值法测定胃癌微血管密度，发现病理分级之间血管密度的标准差极大，使实验结果缺乏可行性和对比性，而采用取血管及瘤组织典型区域多个视野血管平均值作为微血管密度值则取得令人满意的结果，结果显示，应用该方法取得结果之间变异度远小于用单个视野微血管密度值确定法^［13］。因此，采用多视野平均法可减少统计偏差更能代表肿瘤微血管水平，但该方法具有工作量大，易受主观因素的影响。而应用电子计算机软件包CIAS(Computer aided image analysis system)进行微血管计数可减少工作量，进行多点重复计数，但是应用时仍然需要人工选择视野^［8］，显示该技术尚待进一步完善。

运用免疫组化技术能特异性标记肿瘤血管内皮细胞，易于对比观察。F8RA因子是公认的最特异、最常用的血管标记物，阳性率可达70%，但是在许多肿瘤中可不明原因地失表达^［9］，近几年开发的粘附分子CD₃₁和CD₃₄等内皮细胞标记物尽管有较高的敏感性，但特异性较差，易产生假阳性^［10］，在小样本研究中尤其应引起重视。联合应用2种抗体进行研究，可以提高检测效率，仍受到表达缺失的影响。大量临床试验证实，在小样本研究时，难以得出精确的量化界值，以判断肿瘤恶性程度及预后，在不同肿瘤之间也难以此作为进行对比的标准。因此，进一步实验研究应在扩大样本含量的基础上，对实验过程、材料选择、计数方法、统计分析等控制在统一、客观、标准化条件下进行^［11］。随着新抗体的出现，检测技术的提高，免疫组化法有望取得准确可靠的结果。

随着新的血管生成因子不断被发现，利用测定血管生成因子反映肿瘤血管生成能力是肿瘤微血管研究的新进展，如Walker等^［12］测定乳腺癌中VEGF的表达，发现VEGF表达水平与病人微血管密度、恶性程度及预后密切相关。Takanami等在肺癌的研究中，发现bEGF与微血管密度、病理分级及预后也有密切关系^［14］。Krasagakis等^［15］应用酶生物化学法测定黑色素瘤病人血浆中TGFβ₁水平与预后关系获得成功，为术前无创伤检查开辟了新的途径，虽然这类研究成果很少，但对于临床试验研究具有重要意义，是一种极有意义和前途的方法。

肿瘤基因的表达与微血管生成关系研究发现，P₅₃，bc1,nm23,P₁₆等癌基因和抑癌基因与血管生长因子表达、微血管密度密切相关^［16］，显示肿瘤血管生成受瘤细胞基因水平的调控，而肿瘤获得血管生成能力是从无血管期进入血管期进行生长、侵润、转移的关键一步。研究影响肿瘤血管生长的癌基因，有助于解开肿瘤血管生成的机制，为预防和治疗肿瘤提供新的研究方向及理论依据。■

作者简介：于锡欣(1942-)，男，山东文登人，主任医师，硕士导师。主要研究方向：脊柱外科与骨肿瘤。

作者单位：于锡欣（山东省立医院骨科，济南250021）

李孟军（山东省东营市人民医院257091）

参考文献：

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