中华泌尿外科杂志2000年第21卷第3期

许宁石爱平赵忠文

关键词：肿瘤治疗端粒酶

肿瘤治疗的理想靶点应该是肿瘤生长所必需，而正常细胞又不存在的细胞成分。目前的研究结果表明，端粒酶活性在恶性肿瘤组织中的检出率为85%～95%，而在良性肿瘤及正常组织中的检出率仅为4%^［1］，端粒酶的活化可能是细胞永生化或恶化的共同通路，是肿瘤细胞克隆繁衍，使癌症得以发展的重要因素。因此，以限制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗，较单纯针对某个癌基因和(或)抑癌基因的治疗具有更广阔的临床应用前景。现对限制端粒酶活性的策略进行综述。

一、针对端粒酶RNA的操作

(一)针对端粒酶RNA的反义抑制

1.反义寡核苷酸(ASON)的应用：Feng等^［2］的资料显示，只有与模板区RNA及其周围序列互补的ASON才具有端粒酶活性的抑制作用，而远离模板区的ASON则无此作用，说明封闭人类端粒酶RNA(hTR)模板区是反义治疗的核心。针对hTR的ASON治疗肿瘤的体外研究已广泛开展。Glukhov等^［3］观察了ASON对黑色素瘤细胞株SK-Mel-28细胞提取物端粒酶活性的影响，发现ASON在5nmol/L浓度时可成功抑制端粒酶活性，在20nm时可使端粒酶活性达到完全抑制。最近Kondo等^［4］对端粒酶ASON的作用进行了体内研究，发现针对hTR的19个寡核苷酸(ODN)可有效抑制胶质瘤细胞的生长和存活，降低致瘤性，减少肿瘤体积，是非常有效的肿瘤抑制剂。为克服ODN易被核酸酶降解的弱点，肽核酸、硫代磷酸、甲基化等修饰方法在实验中被采用。Norton等^［5］设计了一种多肽骨架即肽核酸(PNA)，它具有与天然DNA分子相似的结构特征，由于不带电荷，其中性同架之间无排斥力，使其具有较高的化学稳定性和退火温度，不易被蛋白酶和核酸酶降解；实验显示，针对hTR模板区13个碱基的PNA，在较低浓度(IC₅₀=0.9nmol/L)时对乳腺癌细胞系HME50-5细胞提取物和细胞内的端粒酶活性有显著的抑制作用，该抑制效率比硫代磷酸的ASON高10～50倍，并且有严格的序列特异性，随PNA浓度的升高而增强。PNA因其诸多优点，成为一种很有希望的反义抑制剂。Pitts等^［6］使用的2′-O-甲基ASON虽亲和力低于PNA，但其在培养的DU145细胞和动物实验中，抑制酶活性的潜力优于PNA。硫代磷酸ASON(PS-ASON)具有抗核酸酶降解，易进入组织及细胞内，良好的药动力学及低毒性等优点使其成为一种有效的端粒酶抑制剂。采用针对hTR模板区的PS-ASON研究其对体外肾癌细胞端粒酶活性及其增殖的影响，结果显示出有效的抑制作用。

2.携带端粒酶反义RNA载体的应用：Feng等^［2］首先采用长片段的端粒酶反义RNA与载体连接后转染Hela细胞，经过23～26个倍增时间后，出现细胞凋亡，并伴随端粒长度27%～31%的缩短，以及端粒酶活性的下降。Kondo等^［7］利用端粒酶反义RNA载体转染胶质瘤细胞后，其中一部分细胞克隆出现诱导凋亡的蛋白酶(ICE)表达增高，发生凋亡；另一部分细胞克隆虽然也出现ICE表达增高，但未发生凋亡，而是表现出其DNA合成、浸润及裸鼠致瘤能力的下降。提示端粒酶抑制剂通过诱导凋亡和分化两条途径，发挥治疗作用。

3.某些癌基因的ASON及抑癌基因的作用：Fujimoto等^［8］发现反义C-myc基因的ODN在Hela、U937和K562细胞系中，对端粒酶活性有抑制作用，而正义的ODN则无此作用；另外，转染端粒酶反义核酸的细胞中ICE，以及p21、p27、Rb等抑癌基因的表达增高^［7，9］。提示利用某些反义癌基因、抑癌基因下调端粒酶活性，也将是肿瘤治疗的另一手段。

(二)针对端粒酶模板区的操作

1.锤头状核酶切割hTR靶序列：核酶是具有核酸内切酶活性的小分子RNA。Yokoyama等^［10］设计了针对hTR的三种锤头状核酶(Telo-RZ)，在肿瘤细胞中分别切割位于33～35(模板区)、168～170及313～315区域的GUC序列，发现靶序列为模板区的核酶消除了端粒酶的活性，将克隆该核酶的表达载体转染另一肿瘤细胞株AN3CA细胞，发现端粒酶活性下降；Kanazawa等^［11］设计了hTR模板区特异靶序列的锤头状核酶，将该核酶与肝癌细胞株HepG2和Huh-7细胞的提取物共孵育，发现端粒酶活性明显受到抑制，Telo-RZ的切割过程具有核酶与底物比值、保温时间、作用温度的依赖性。以上结果表明，核酶可能成为一种高效、低毒的肿瘤抑制剂。

2.内源性核酸酶的激活：Kondo等^［4］使用针对hTR模板区的19个核苷酸的ASON，使其与2′-5′-寡腺苷酸(2′-5′-A)相连，2′-5′-A具有激活内源性核糖核酸酶、核酸酶L的功能，可使结合的靶RNA单链片段发生降解，达到有效抑制端粒酶模板的作用。

3.hTR模板区的定点突变：诱导端粒酶模板区突变，从而合成含有突变的端粒重复序列，或者竞争地结合于端粒相关蛋白上，抑制正常端粒的合成。Yu等^［12］对四膜虫端粒酶模板区进行定点突变，经过Southern blot检测发现其端粒序列改变，突变株呈现衰老，细胞及核形态不规则，细胞分化能力明显减弱。Feng等^［2］将Hela细胞hTR模板区序列突变为CCAACCCCAAC-3′(MuC)和CAAACCCAAAC-3′(MuA)，用RT-PCR检测出端粒序列的相应改变和正常端粒的减少。

二、针对端粒酶蛋白组分和端粒结合蛋白的操作

1.端粒酶蛋白：是维持端粒酶结构和功能所必需，因此抑制此类蛋白质必将降低端粒酶活性。目前国内外许多实验室都在致力于克隆人类端粒酶蛋白组分。Meyerson等^［13］和Nakamura等^［14］已报道克隆了人类端粒酶催化亚基(hEST2/hTRT)，该催化亚基在多种肿瘤细胞株和组织中表达，并与端粒酶活性关系密切^［15-17］。Sogawa等^［18］发现一种海洋微藻类多糖可抑制K562细胞的端粒酶催化亚基的表达，并抑制端粒酶活性。

2.端粒结合蛋白：端粒结构由端粒重复序列和端粒结合蛋白(TRF)组成，TRF包括两类，TRF1调节端粒的长度，TRF2维持端粒的完整性。Jan等^［19］分别构建了缺乏功能区的TRF1和TRF2的腺病毒表达载体，载体的表达产物具有抑制TRF1和TRF2的作用。其转染多种肿瘤细胞和成纤维细胞后，发现TRF1的抑制蛋白表达，虽然减少了TRF1的量，并未引起细胞凋亡；而TRF2的抑制蛋白表达则引起细胞迅速凋亡，并且这种反应被p53和ATM(ataxia telangiectasia mutated)激酶所调节。提示端粒不完整或缩短可以不通过衰老途径而直接引发凋亡信号，抑制端粒结合蛋白引起的细胞生物学效应发生迅速，因此在今后的应用可能有更大的潜力。

三、逆转录酶抑制剂、底物竞争抑制剂的应用

1.逆转录酶抑制剂、核苷三磷酸类似物的作用：hTR以其自身RNA为模板反转录合成端粒DNA的过程，可被逆转录酶抑制剂所阻断；另外，核苷三磷酸类似物能和正常单核苷酸竞争其与模板区RNA的结合，造成转录链终止，达到抑制端粒酶活性和限制端粒扩充的目的。Catherine等^［20］应用逆转录酶抑制剂叠氮胸苷(A-ZT)以及各种双脱氧核苷酸(ddN)处理两个淋巴瘤细胞株，B淋巴瘤JY616及T淋巴瘤E6-1，发现AZT和ddG可有效地抑制端粒酶活性，缩短端粒长度，而ddI、ddA及d4T则无明显作用。Terace等^［21］研究7-脱氮-dATP(7-deaza-dATP)和7-脱氮-dGTP对端粒酶活性的抑制作用，其IC₅₀各自为11μmol/L和8μmol/L。上述结果显示出竞争性逆转录抑制剂的良好应用前景。

2.模拟端粒寡核苷酸的抑制作用：Mata等^［22］设计了模拟端粒序列的ODN六聚体(5′dTTAGGG3′)，作为端粒酶的底物，能与正常端粒竞争端粒酶的结合位点，达到抑制端粒酶活性，限制端粒扩充的目的。体外实验中，该ODN能有效抑制伯基特淋巴瘤细胞株OMA-BL1细胞的生长，延长倍增时间，诱导细胞凋亡；体内实验中，每日给予荷瘤鼠50μgODN六聚体，可引起肿瘤体积明显缩小及转移淋巴结数目减少，并且这种抑制作用具有剂量的依赖性。因此一些序列类似端粒的ODN可竞争性抑制端粒DNA与端粒酶的结合，是有效的肿瘤抑制剂。

四、分化诱导剂的应用

在正常分化的体细胞中检测不到端粒酶活性，而在未分化的组织干细胞或肿瘤细胞中端粒酶活性高表达，提示端粒酶与细胞分化密切相关，随着细胞分化的进行，端粒酶活性逐渐降低以至消失。Sharma等^［23］研究发现，促分化剂二甲基亚砜能可逆地抑制伯基特淋巴瘤Raji细胞系的端粒酶活性，使细胞生长抑制，停滞于G₁期。在体外培养的前列腺癌细胞系LNCAP和PPC-1细胞中加入分化诱导剂1，25-二羟维生素D₃，结果细胞分化能力增强，端粒酶活性和增殖能力下降^［24］。此外，TPA、维甲酸等分化诱导剂，也被证实可诱导肿瘤细胞终末分化，并下调其端粒酶活性^［25］。分化诱导剂对端粒酶活性、细胞增殖及分化产生深远的影响，是很有希望的抗肿瘤药物。

五、染色体转导的应用

研究表明，3号、7号、11号染色体与端粒酶、端粒的调节有关。尤其3号染色体上的某些基因，对端粒酶催化亚基的表达和端粒酶活性有明显的抑制作用^{［26，27］}。Ohmura等^［28］实验证实，将正常的3号染色体导入该染色体缺失的肾癌细胞中，可抑制其生长，恢复其衰老的调控，并且这种<