第四军医大学学报1999年第20卷第9期

崔大祥王岭闫小君苏成芝王剑波

摘要目的：检测nm23-H1与muc1基因在乳腺癌中的表达水平，探讨nm23-H1与muc1在乳腺癌原发灶与转移灶中表达水平改变的临床意义．方法：采用定量RT-PCR与图像扫描定量分析技术检测22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶中nm23-H1与muc1基因的表达水平．结果：①在22例有家族史的原发灶中,nm23-H1基因在10例无转移的标本中检出率为8/10，12例转移淋巴结中检出率4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，nm23-H1基因在40例无转移的原发灶中检出率为34/40，20例转移淋巴结中检出率为7/20，癌旁组织中检出率为39/60；无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）；②nm23-H1基因在乳腺癌原发灶呈高表达，在转移灶中呈低表达，表达量在两者之间存在显著性差别（P＜0.001）；nm23-H1基因表达水平的高低与乳癌的分级、病理类型、家族史无关；③muc1在22例有家族史的无转移原发灶中检出率为2/10，转移淋巴结中检出率为10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为10/40，20例转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60；无转移的原发灶与转移灶之间的检出率存在显著性差异（P＜0.01）；④muc1基因在乳腺癌原发灶中呈低表达，在转移灶中呈高表达，表达量在两者之间存在显著性差别（P＜0.01）;muc1基因表达与乳癌的分级、病理类型、家族史无关；⑤22例检出nm23-H1低表达的标本中20例检出muc1高表达．结论：nm23-H1低表达及muc1高表达与乳腺癌转移密切相关，检测nm23-H1与muc1基因的表达程度可能有助于判断乳腺癌是否转移；nm23-H1低表达与muc1高表达可能在乳癌转移过程中具有内在联系．

关键词：乳腺癌nm23-H1muc1基因表达定量RT-PCR

0引言

乳腺癌是乳腺管上皮细胞恶性变而来，很容易转移到周围的淋巴系统中．乳腺癌分成两类，即遗传性乳腺癌与散发性乳腺癌．目前认为，乳腺癌的发生与遗传因素、内分泌因素、高脂肪饮食、酒精及病毒感染等有关．乳腺癌的转移与多种因素有关．nm23-H1是目前研究最多的转移抑制基因，muc1编码的蛋白是重要的乳癌相关抗原，但它们是否为乳癌转移的基因标志物，尚无定论．我们采用定量RT-PCR与图像扫描定量分析技术对22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶进行研究，旨在探讨nm23-H1与muc1在乳腺癌原发灶与转移灶中基因表达异常的临床意义，为深入研究它们在乳癌转移中的作用奠定基础．

1材料和方法

1．1材料①病例及标本：所有标本皆由西京医院提供并经病理H．E染色确诊，22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶由西京医院王岭副教授提供．②nm23-H1与muc1质粒由本室保存．③nm23-H1与muc1引物运用网络上的站点www．williamstone．com/index．html软件进行设计．nm23上游引物为CCAACTGTGAGCGTACCTTC，下游引物为TCATAGATCCAGTTCTGACC，扩增片段长度为450bp；muc1上游引物为CGTCATGGACATTGATGGTACC，下游引物为GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA,扩增片段长度为228bp；对照β-actin引物为CACTGTGTTGGCGTACAG

gT与TCATCACCATTGCAATGAG，扩增长度为154bp．④反转录酶及Taq酶、dNTPs皆购自宝灵曼公司．⑤DOC-1000型图像扫描定量分析系统是BioRad公司产品．

1．2方法^［1］①RNA的提取：将组织剪碎后按异硫氰酸胍一步法提取总RNA并扫描定量．②mRNA反转录：10×RTbuffer2μL，10mmol/LdNTP2μL，随机引物2μL，RNasin1μL（20U/μL），无RNase水10μL，总RNA模板2μL（0.2μg/μL）混匀后，离心数秒，采用65℃5min，37℃60min，75℃5min，MMLV反转录酶在37℃10min时加入．③PCR扩增：取反转录产物2μL作模板，依次加入ddH₂O21μL，10×PCRbuffer3μL，2.5mmol/LdNTP3μL，上下游引物与β-actin引物各取1μL，Taq酶1．5U，混匀后，离心数秒，加入30μL石蜡油，采用94℃35s，55℃55s，72℃1min，35个循环，最后在72℃延伸7min．④结果判断标准：每次PCR扩增皆设立阳性、阴性对照，各取产物15μL进行10g/L琼脂糖凝胶电泳20min，EB染色，用DOC-1000型图像扫描定量分析系统对电泳分离出的片段进行扫描，获取相对A值，产物A值/β-actinA值比值＞1为高表达，＜1为低表达，=0为未检出表达；比值作为定量结果，运用t检验进行统计学处理．

2结果

2．1RT-PCR检测nm23与muc1基因的特异性分别以β-actin作阳性对照，ras质粒作阴性对照，组织总RNA作模板，进行RT-PCR扩增，结果表明只有β-actin产物片段、nm23-H1与muc1产物片段出现，说明引物具有特异性(Fig1)．

图1RT-PCR结果

fig1Results of RT-PCR

1：Positive control；2：Negative control；3：Marker;

4：Production of muc1；5：Production of nm23．

2．2定量RT-PCR检测nm23-H1结果22例有家族史的原发灶中,10例无转移的标本中nm23检出率为8/10，12例转移淋巴结中检出率4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为34/40，20例转移淋巴结中检出率为7/20，癌旁组织中检出率为39/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）,表达量在两组之间存在显著性差异（P＜0.01），表明检测nm23-H1有无表达异常对乳腺癌转移的判断具有重要意义．

2．3定量RT-PCR检测muc1结果22例有家族史的无转移原发灶中muc1检出率为2/10，转移淋巴结中检出率10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为10/40，20例转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）,表达量在两组之间存在显著性差异（P＜0.01），表明检测muc1表达异常对乳腺癌有无转移的判断可能具有重要意义．

2．4nm23-H1与muc1表达改变与乳腺癌病理类型nm23-H1在侵润性小叶癌、粘液癌、小细胞未分化癌中检出率稍高，muc1在导管原位癌、官状腺癌中检出率稍高，但无统计学上的差异．

2．5nm23与muc1表达改变与乳腺癌组织分级在不同类型的乳腺癌中，肿瘤分化越差，nm23检出率越低，但分化好的Ⅰ级和Ⅱ级与分化差的Ⅲ级之间，无显著性差异；muc1在不同类型的乳腺癌中，肿瘤分化越差，检出率越高，但分化好的Ⅰ级和Ⅱ级与分化差的Ⅲ级之间，无显著性差异．

2．6nm23-H1与muc1表达改变在乳腺癌中的关系22例检出nm23-H1低表达或无表达的标本中20例检出muc1高表达，还有6例muc1高表达的标本中nm23-H1呈高表达，标本中nm23-H1的低表达与muc1高表达在两者之间存在一定的相关性（r=0．8869）．

3讨论

乳腺癌是女性生殖系统中发病率最高的恶性肿瘤，易侵犯淋巴结与转移到腋窝等部位，临床对转移与非转移的患者治疗方法不一样．因此，寻找判断肿瘤有无转移的基因标志物对临床乳腺癌患者的诊断治疗具有重要的指导意义．

nm23基因是目前研究最多的转移抑制基因．nm23基因在分化良好的肿瘤中呈高水平表达，且nm23基因表达与淋巴结转移呈负相关，与患者无病生存期、整个生存期呈正相关^［2,3］．muc1基因是一个十分重要乳腺癌相关抗原基因，muc1基因选择性拼接可在腺癌细胞膜表面及胞浆表达mucin蛋白，而在正常乳腺细胞表达很弱或无．进一步研究表明，muc1基因的编码产物是十分重要的乳癌标志物^［4～6］．nm23基因与muc1基因是否与乳腺癌转移有关？是否为乳癌转移的重要基因标志物？目前未见文献报道．

本实验结果显示：22例有家庭史的无转移的10例乳腺癌原发灶中nm23-H1检出率为8/10，转移淋巴结中检出率为4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为32/40，转移淋巴结检出率为7/20，癌旁组织中检出率为45/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01），表明检测nm23-H1低表达异常对乳癌转移的判断具有重要意义；nm23-H1表达异常可能与乳癌家族史无关．22例有家族史的无转移的10例原发灶中muc1检出率为2/10，转移淋巴结中检出率为10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳癌中无转移的原发灶中检出率为10/40，转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60，无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异(P＜0.01)，表明muc1高表达与乳癌转移密切相关，检测muc1表达异常对乳癌有无转移的判断可能具有重要意义．进一步统计分析显示，nm23-H1与muc1表达改变与乳癌病理类型无关，与乳癌组织分级无显著相关．因此，nm23-H1基因与muc1基因可能是与乳腺癌转移有关的基因标志物，但特异性如何仍有待于进一步研究．

实验结果示：22例检出nm23低表达或无表达的标本中20例检出muc1高表达，表明nm23-H1与muc1<