国外医学流行病学传染病学分册2000年2月第27卷第1期

中国人民解放军第三○二医院、传染病研究所基因治疗研究中心（100039）刘妍（综述） 成军（审校）

摘要从丙型肝炎病毒（HCV）体外转化NIH3T3细胞系列转基因小鼠的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）形成，证明HCV感染与HCC产生有密切关系。HCV致HCC产生主要是通过病毒基因组编码蛋白的生物学作用而实现的；核心蛋白能够调节包括p53基因在内的多种原癌基因或抑癌基因启动子的转录活性，干扰TNF相关的细胞信号传导，对肝细胞凋亡、生长分化产生影响；非结构蛋白NS3具有丝氨酸蛋白酶及RNA解旋酶活性，与HCV致癌性有关；非结构蛋白NS5与肝细胞中RNA依赖的蛋白激酶（PKR）结合，使PKR失去失常的生长抑制功能。

关键词：HCV肝细胞癌分子生物学

自1989年Choo等成功地获得第一个HCV cDNA克隆后短短十年间，有关HCV的研究不断深入。HCV感染不仅可引起急、慢性肝炎，而且与肝纤维化、HCC的发生密切相关。但HCV感染HCC发生、发展的仉制仍不十分清楚。目前认为，HCV进入肝细胞后，病毒基因组及其编码的蛋白与肝细胞基因组及蛋白之间的相互作用是决定HCV复制、表达、免疫逃逸、慢性感染、肝纤维化及致恶性转化的关键因素。

1.HCV致HCC的分子生物学证据

1.1 HCV非结构蛋白NS3体外转化NIH3T3细胞系

HCV非结构蛋白NS3分子量约70kDa，具有丝氨酸蛋白酶及RNA解旋酶活性；NS3蛋白与HCV致病性有关，并可能在HCC发生中起重要作用。Sakamuro等^〔1〕探讨了HCV nS3蛋白的转化潜能，用NS3 cDNA重组质粒转染小鼠成纤维细胞NIH3T3，发现NS3转染的细胞具有转化特性，且转化细胞移植入裸鼠体内可形成纤维肉瘤灶。缺失突变研究表明，NS3致瘤活性相关区域可能位于NS3 n端部分（编码区位于3354～4210nt），此部分包括丝氨酸蛋白酶和部分RNA解旋酶活性区。体外翻译分析及真核细胞表达系统研究发现，HCV nS3丝氨酸蛋白酶裂解位点不同于其他黄病毒属，可能与某些调节细胞功能的癌基因产物相互作用，如裂解c-raf癌基因产物N末端使之激活，启动肿瘤形成。NS3还可能通过解旋酶活性诱导肝细胞基因组的不稳定性，甚至发生突变。另外，NS3能与蛋白激酶A（PKA）催化亚单位特异性结合，可能干扰蛋白激酶A与细胞内信号传导过程，严重影响细胞正常功能。

1.2 HCV核心蛋白转化REF细胞

Ray等^〔2〕研究了HCV核心蛋白对原代大鼠胚胎成纤维细胞（Rat embryo fibroblast,REF）的转化潜能。HCV core基因与H-ras或c-myc基因共同转染REF细胞，稳定的转染子发生转化，表现为细胞快速增殖、无贴壁依赖性生长、致裸鼠肿瘤形成；而单独转染HCV core或H-ras或c-myc基因却不能产生同样效应。结果表明，HCV核心蛋白在HCV感染的细胞生长调节及恶性转化中起重要作用，作用机制可能为核心蛋白的核定位作用对细胞生物信号传导的影响。

但最近也有研究^〔3〕认为，HCV核心蛋白虽有致癌的潜能，可能转化Rat-1细胞系，却并不能使共转染H-ras的REF细胞发生转化。

1.3HCV核心蛋白转基因小鼠

HCV与HCV密切相关的最直接的实验证据是HCV转基因动物的研究。Moriya等^〔1〕用编码HCV核心蛋白的基因（Ⅰb基因型）转入小鼠基因组，转基因小鼠早期出现慢性丙型肝炎的组织学特征，如脂肪变性；在16月龄后发生了HCC，其病理组织学特征及演变过程与慢性HCV感染致早期HCC相似；电镜观察发现，HCV核心蛋白聚集于小鼠肝细胞核及线粒体内，推测HCV核心蛋白可能作为转录调节因子，推测HCV核心蛋白可能作为转录调节因子，调节细胞异常增殖；线粒体内HCV核心蛋白的聚集与脂肪变性有关，而后者在HCC形成中可能起重要作用。

2.HCV基因编码产物转录调节作用

Ray等^〔1〕把HCV核心蛋白基因克隆到哺乳动物表达载体中，研究编码产物对细胞原癌基因和病毒启动子的转录调节作用。实验表明，HCV核心蛋白能够激活人c-myc启动子、劳氏肉瘤病毒（RSV）LTR、SV40早期启动子。缺失突变研究显示，核心蛋白反式激活人人c-myc启动子的决定区域定位于其第58～121位氨基酸残基中，此区包含两个核定位信号和一个DNA结合区。但HCV核心蛋白抑制HIV-1 lTR转录活性，提示HCV核心蛋白对病毒启动子作用是双相的；高浓度的HCV核心蛋白对人c-fos基因有抑制作用。研究证明，c-myc的反式激活作用与HCC形成有关，因而推测HCV核心蛋白可能作为一种基因调节蛋白，与包括原癌基因在内的调节细胞生长分化的一种或多种因子相互作用，使正常肝细胞生长失去控制，最终形成HCC。

Kim等^〔6〕研究表明，完整的HCV核心蛋白能反式抑制多种基因表达，如SV40早期启动子、c-fos原癌基因、抑癌基因Rb、β-IFN基因及看家基因β-肌动蛋白（β-actin）基因等，认为HCV长期持续感染能够广泛下调HCV感染的靶细胞中多种基因的表达及病毒基因复制。基中对Rb基因表达的抑制作用，从一个侧面说明了核心蛋白能下调细胞肿瘤抑制基因表达而导致肿瘤发生。

3.HCV核心蛋白对细胞凋亡的调节

HCV核心蛋白能够抑制细胞凋亡的启动，这种作用与HCV持续感染及感染细胞无限增殖并发生肿瘤密切相关。Ray等^[7]研究发现，HCV核心蛋白的表达能够抑制顺铂介导的人宫颈上皮细胞凋亡，也能够抑制由c-myc癌基因过表达诱导的中国仓鼠卵母细胞的凋亡，这可能是HCV核心蛋白阻断p53功能造成的。HCV核心蛋白能抑制p53启动子的转录活性^[8]，功能位点在核心蛋白的第80～122位氨基酸残基之间。p53基因是一种经典的抑癌基因，是细胞凋亡非常有效的诱导剂，在多种恶性肿瘤中，p53基因发生突变或表达水平异常。在HCV相关的HCC中，p53基因第七外显子249密码子处有G→T转换和G→T/A→T颠换突变，而突变的p53基因不仅使其表达的p53的抑癌活性丧失，反而出现促进恶性转化的活性，p53基因由抑癌基因转变为癌基因。

但也有实验表明，在不同的细胞系中，HCV核心蛋白能增强被感染细胞凋亡的敏感性，如Fas介导的细胞凋亡^[9]、肿瘤坏死因子受体1（TNF r1）^[10]和淋巴毒素β受体（Lymphotoxin-β receptor,LTβR）^[11]介导的细胞凋亡等，因而认为与HCV所致细胞感染及肝细胞坏死，增殖有关。

4.HCV核心蛋白对TNF信号传导的影响

Matsumoto等^[11]用酵母二杂交筛查系统研究发现，HCV核心蛋白与LTβR之间存在相互作用，后者是肿瘤坏死因子受体（TNF r）超家族成员，两者结合区域位于LTβR胞浆区尾部的58个氨基酸和HCV核心区N端第36～91位氨基酸残基。LTβR参与外周淋巴器官发育调控、发生中心形成、淋巴结发生及凋亡信号传导等，而HCV核心蛋白与胞膜LTβR相互结合，可能干扰了LTβR与肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3，TNF receptor associated factor 3）间的信号传导，或者与内质网LTβR相互结合，干扰LTβR向细胞表面转运，从而影响正常的免疫功能，使HCV逃逸宿主的免疫攻击而造成长期的持续感染及肿瘤发生。

Zhu等^[10]研究发现，在HeLa和HepG2细胞系中HCV核心蛋白与TNF r1胞浆区细胞系中HCV核心蛋白与TNF R1胞浆区相互结合，增强了TNF诱导的细胞凋亡。TNF r1 C末端62个氨基酸残基（345～407aa）是其与核心蛋白结合的关键结构，此区是TNF r1的“死亡区”（death domain）,介导细胞凋亡信号传导；核心蛋白与TNF r1的结合部位位于其N端115个氨基酸残基。HCV核心蛋白与TNF R1结合并未上调TNF r1 mRNA水平及细胞表面TNF R1表达，推测可能是使TNF R1对TNF应答的敏感性增加。TNF r1胞浆区可与多种相关的细胞信号传导蛋白相结合，其中受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)、TRAF2与TNF诱导的NF-κB和c-Jun N-末端激酶（c-Jun n-terminal kinase,JNK)激活有关，而Fas相关死亡蛋白（Fas associated death domain protein,FADD)和TNF受体相关死亡蛋白（TNF receptor associated death domain protein,TRADD）能诱导细胞凋亡。HCV核心蛋白与TNF r1胞浆区结合可能会抑制或增强上述相互作用过程，从而改变TNF r1的信号传导；除与细胞凋亡有关外，还影响HCV感染的细胞增殖、分化及慢性炎症形成等，在HCV感染的致病过程起重要作用。

最近有研究^[12]显示，在HuH-7和HeLa细胞中表达的HCV核内蛋白能增强TNF-α或LT-α1β2（LTβR的配体）诱导的NF-κβ的DNA结合活性。这种调节作用一方面是因为HCV核心蛋白延长了NF-κB（p50或p60）在胞核内的滞留时间，另一方面是因为HCV核内蛋白增强了由TNF-α或LT-α1β2诱发的IκB-β的降解。但HCV核心蛋白对TNF-α刺激的JNK活性却无明显的影响。结果提示这种调节作用促使了HCV慢性持续感染。

5.HCV非结构蛋白NS5A对RNA依赖的蛋白激酶（PKR）的影响

肝细胞中RNA依赖的蛋白激酶（PKR）是干扰素（IFN）诱生的一种细胞蛋白激酶，是IFN信号传导途径的主要效应因子，IFN主要通过其诱生的细胞蛋白介导抗病毒活性。研究表明^[13]，HCV非结构蛋白NS5A能与肝细胞中RNA依赖的蛋白激酶（PKR）相互作用。NS5A c端有一组编码40个氨基酸（2209～2248aa）的序列是干扰素敏感决定区(interferon se