国外医学耳鼻咽喉科学分册2000年第24卷第1期

中山医科大学附属孙逸仙纪念医院耳鼻咽喉-头颈外科（广州 510120）陈良嗣(综述)彭解人(审校)

摘要P⁵³基因是抑癌基因，其野生型抑制细胞恶性转化，突变型与许多肿瘤的发生密切相关，本文对P⁵³基因及其表达产物的结构、功能；在头颈肿瘤中的表达；重组腺病毒介导的P⁵³基因治疗头颈肿瘤的原理、研究进展和头颈肿瘤化疗、放疗关系等进行综述。认为重组腺病毒介导的P⁵³基因治疗头颈肿瘤的方法可能成为头颈肿瘤基因治疗的突破口。

关键词：重组腺病毒介导P⁵³基因头颈肿瘤

抑癌基因（tumor suppressor gene）是正常细胞生长增殖的负调节信号，其功能为：①诱导终未分化；②维持基因的稳定性；③触发衰老，诱导细胞的程序性死亡。当抑癌基因的结构与功能发生改变时，就失去了细胞增殖的负调节作用，同时产生使细胞增殖的信息。1989年原先被认为是癌基因的P⁵³被证明是抑癌基因，对P⁵³研究热潮使P⁵³成为1993年的分子明星（molecule of the year）随着对P⁵³基因研究的深入，目前已深入到应用腺病毒载体重组野生型P⁵³基因进行肿瘤治疗阶段^[1]，本文就有关问题进行综述。

【P⁵³基因及其表达产物的结构与功能】人P⁵³基因定位于17号染色体短臂21～22区，基因组DNA长约20Kb，由11个外显子和10个内含子组成。P⁵³基因分为野生型（wt）和突变型（mt），野生型在维持细胞正常生长，抑制恶性增殖过程中起主要作用，是细胞生长的“监控器”。当细胞DNA受损时，能使细胞分裂终止在G₁/S期，抑制细胞分裂，以便细胞有足够的时间修复损伤，恢复常态。因而P⁵³被称为“基因组的保护神（guardian of the genome）”野生型P⁵³还可启动另一组基因使受损的细胞自杀而亡（凋亡，apoptosis）^[2]，这是多细胞生物清除“叛逆”，保存整体的重要策略，由于P⁵³在哺乳类动物细胞凋亡中扮演关键角色，又获得“组织学的保护神”（guardian of the tissue）的雅号。

野生型P⁵³所编码的野生型P⁵³蛋白，在细胞中易水解，半衰期很短（约6～20分钟）故一般方法难以检测。野生型P⁵³基因的抑癌活性正是通过野生型P⁵³蛋白进行。其机制可能是P⁵³蛋白启动WAF/Cipl基因的表达，产生P²¹的蛋白，P²¹抑制cdk活性，从而抑制细胞周期，使细胞生长的增殖受抑制^[3]。突变型P⁵³不仅失去了正常的野生型P⁵³的抑癌作用，而且具有癌基因的功能。目前已发现P⁵³基因在50%左右的人体恶性肿瘤中发生了突变或缺失。

突变型P⁵³蛋白较野生型P⁵³蛋白稳定，半衰期为2～12小时不等，因此利用免疫组化仅能测出突变型P⁵³蛋白^[1～8]，除免疫组化分析外，目前研究P⁵³基因突变的方法还有PCR-SS-CP、PCR-RFLP及DNA测序法等。突变型P⁵³蛋白如何发挥效应目前有两种假说，一种认为突变蛋白与野生型单位结合形成异寡聚体复合物，干扰野生型蛋白亚基的功能。另一种认为突变的P⁵³能获得胜过小量野生型负性调节作用的新功能，表明细胞中野生型和突变型P⁵³的比例可能是调节细胞增殖，分裂的关键。此外，P⁵³某些氨基酸残基的突变对温度敏感，呈现出构象变化。如野生型蛋白是32℃，突变蛋白是37～39℃。在37～39℃时呈突变构象的P⁵³位于细胞质内不能阻断细胞生长。反之在32℃时，野生型P⁵³移动到细胞核内阻止细胞生长^[7]。

【P⁵³基因在头颈肿瘤中的表达】①鼻咽癌（NPC）。对NPC中P⁵³的变化目前尚有争议。Lo等^[8]发现NPC细胞系中P⁵³基因突变率＜10%，原发灶中未发现突变。P⁵³突变者多发生在外显子4～8。EB病毒在NPC中起重要作用，勿需P⁵³突变。Sun等^[9]研究发现NPC细胞中P⁵³基因密码子280存在G→C的杂合性点突变，该突变引起Arg（精氨酸）取代Thr（苏氨酸）。这是一种功能获得性突变，具调节致癌的活性。Sheu等^[10]研究表明NPC中P⁵³异常表达率较高。其过量表达可见于95.1%的患者，在NPC的组织类型中分化愈差，表达率愈高。而且表达率的高低与颈淋巴转移倾向呈正相关。Chen等^[11]将野生型和突变型P⁵³基因分别转染NPC细胞CNE-3。并比较两者在裸鼠体内的成瘤性，结果表明wtp⁵³可抑制CNE-3在祼鼠体内生长，而mtp⁵³则加速该细胞在体内生长，从而支持P⁵³在NPC发生、发展中起重要作用的观点。

②口腔肿瘤。 口腔肿瘤的发生与P⁵³突变密切相关。kiuru等^[12]报道口腔瘤中P⁵³基因最显著的突变为CpG位置上G：C→A：T的转换，占突变类型的50%。portugal^[13]等用免疫组化检测58例口腔鳞癌，发现P⁵³突变率为58%，随肿瘤分期病变增加，P⁵³突变率升高，但无统计学意义。有意义的是吸烟饮烟与P⁵³突变呈明显正相关，与HPV是负相关，且HPV表达在口腔癌中是恶化指标，因此作者认为P⁵³基因不是独立影响口腔癌行为的因素。

③甲状腺癌。Ito等^[14]报道在未分化甲状腺癌中，P⁵³突变率达86%（6/7），乳头状癌中突变率为0（0/10）。kikuchi等^[15]发现甲状腺乳头状腺癌经治疗预后佳。进一步研究发现治疗后的腺癌细胞中DNA碎片较良性状腺肿瘤或正常甲状腺组织更常见。又因为肿瘤组织中仅有P⁵³基因的表达增加，而且在癌组织，良性肿瘤组织、正常甲状腺组织中无其它基因（Fas、TNF、BCL-2等）的表达。作者认为由wtP⁵³诱导的细胞凋亡或血管抑制因子产物与甲状腺乳头状腺癌的良好预后有关。

④喉癌。Kiuru等^[12]报道喉癌中P⁵³基因最常见的突变是G：C→T：A颠换，占突变类型的50%，并认为该突变可能与致突变因素----吸烟有关。Pruneri等^[16]报道喉癌标本（18例）中突变型P⁵³阳性者20%有P^53p表达；P⁵³阴性者80%有P^53p表达，在携带野生型P⁵³（7/11）或携带突变型P⁵³（2/4）喉癌组织周围的正常和非典型增生粘膜中，P^53p过度表达很频繁。P⁵³免疫性细胞在正常和不完全非典型增生粘膜中的分布层次与完全非典型增生粘膜中的分布层次不同。作者认为，P^53p过度表达可能成为喉癌多阶段形成中最早期的标志物。

【重组腺病毒介导的P⁵³基因治疗头颈肿瘤的原理】基因治疗就是将外源正常基因插入体细胞内以纠正特定蛋白质的异常或缺失。通常有两种途径：一种是异常基因存在下转染正常基因（添加治疗）；另一种是通过同源重组的正常基因取代异常基因（替换治疗）。根据选择目的基因不同，目前已开展的头颈肿瘤基因治疗主要分为针对癌基因；针对药物敏感基因；针对肿瘤免疫基因；针对耐药基因；针对抑癌基因等几个方面。

基因治疗离不开有效的转移系统，其关键在于选择合适的载体，人类腺病毒为无包膜的DNA病毒，由20面体的蛋白质外壳和蛋白核酸组成，基因组为双螺旋线性双链DNA，长约36kbp。腺病毒作为肿瘤基因治疗的载体因具备以下特点而越来越受关注^[17，18]：①易于培养和纯化；②理化性质较稳定，载体比较容易制备，操作较简单；③宿主范围广，较其它病毒（如逆转录病毒）感染率高；④既感染增殖细胞也感染非增殖细胞；⑤病毒DNA一般存在细胞染色体外，整合突变致癌或遗传毒性可能性小。许多研究表明，单细胞内P⁵³抑癌基因丢失、失活或突变将导致细胞恶变，而野生型P⁵³（wtP⁵³）所编码的蛋白质具有肿瘤抑制活性，且可使肿瘤细胞凋亡。因此用重组腺病毒转移系统将wtP⁵³转导入肿瘤细胞中，以野生型P⁵³基因替代失活的P⁵³基因，恢复其诱导终未分化，维持基因稳定，触发衰老，诱导细胞凋亡和调节细胞生长的功能。

【重组腺病毒介导的P⁵³基因治疗恶性肿瘤的研究进展】重组腺病毒介导的P⁵³基因治疗恶性肿瘤刚刚起步，尚处于临床前期。1995年美国FDA批准用重组腺病毒-P⁵³（Ad-P⁵³）基因治疗肺癌（NSCLC）和头颈肿瘤（HNSCC）两个临床实验方案。1997年该方案临床I期实验结果已证实是安全、有效、可行的^[18]。目前在头颈肿瘤方面已有一些相关报道。Liu等^[19]用野生型P⁵³通过重组腺病毒载体（Ad5CMV）介导来抑制头颈肿瘤细胞的生长。感染率超过80%，Northem blotting显示外源性P⁵³RNA的水平在转染细胞中是未转染者的的10倍。Western blotting显示转染细胞中P⁵³蛋白表达增加。体内试验发现，转染后肿瘤细胞表态上的变化与凋亡一致。体内试验发现裸鼠体内的肿瘤结节体积明显缩小。

Clayman等^[20]在裸鼠内建立了一个类似头颈鳞癌术后的微小残余灶模型。感染Ad5