第四军医大学学报1999年第20卷第10期

朱翔李青王文亮孙力赵宏喜张献志

摘要目的： 探讨凋亡相关基因bak在人肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达及其对肿瘤发生的意义.方法： 应用免疫组织化学的SABC方法，和兔抗人Bak多克隆抗体，对23例肾上腺嗜铬细胞瘤（其中良性18例，恶性5例）和10例正常肾上腺组织进行了检测.结果： Bak在正常肾上腺髓质中不表达，而在良恶性嗜铬细胞瘤中表达，阳性率分别为89%和40%. 在良性肿瘤中Bak表达显著强于恶性肿瘤.结论： Bak不同程度地参与了良恶性嗜铬细胞瘤中的凋亡调控，对良恶性嗜铬细胞瘤鉴别诊断的意义有待深入研究.

关键词：嗜铬细胞瘤凋亡Bak免疫组织化学肾上腺肿瘤

0引言

Bak (Bcl-2 homologous antagonist/killer) 是Bcl-2家族的新成员，同Bax一样，列为此家族中促进凋亡的成员之一^［1］. Bak在正常组织中有广泛的表达，在人正常肾上腺中，Bak在皮质中表达，而在髓质不表达^［2］. 肾上腺嗜铬细胞瘤(adrenal pheochromocytoma)是髓质嗜铬细胞发生的肿瘤，属于神经内分泌肿瘤，持续或间断地分泌大量的儿茶酚胺，是临床高血压病的一个病因. 嗜铬细胞瘤大多为良性，但常常病情凶险，而恶性嗜铬细胞瘤则预后不佳. Bak在嗜铬细胞瘤中的研究尚未见报道. 我们从凋亡的角度，以Bak入手，探讨肾上腺嗜铬细胞瘤的发生.

1材料和方法

1.1标本为本校西京医院病理科收集的1984～1998肾上腺嗜铬细胞瘤手术切除标本，，共23例（其中良性18例，恶性5例），另收集10例尸检中的正常肾上腺组织. 全部标本均为100 mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片. 用嗜铬粒蛋白A的抗体对嗜铬细胞瘤和正常肾上腺髓质进行定性检测，均为阳性.

1.2方法免疫组织化学染色采用SABC法，并用微波炉对抗原进行修复. 兔抗人Bak多克隆抗体、 SABC试剂均购自武汉博士德生物工程公司，抗体的工作浓度为1∶100，其余抗体按产品说明稀释. DAB显色，苏木精衬染，常规封片观察. 阴性对照的设置以磷酸盐缓冲液和正常兔血清分别代替一抗作为空白对照和替代对照，并以肾组织作为阳性对照. 胞质中呈现棕黄色颗粒者为阳性细胞. 若标本中无阳性反应细胞，背景同空白对照者为阴性. 统计学分析，阳性率的比较采用卡方的确切概率法检验.

2结果

在阳性对照中，肾小球细胞内未见阳性产物，而在远曲小管上皮细胞胞质内可见棕黄色颗粒物质为阳性物质. 在阴性对照中均未见免疫反应阳性物质. 在10例正常肾上腺皮质中，球状带，束状带，网状带均可见Bak表达，Bak阳性产物主要在胞质中表达，而在髓质中则为阴性. 嗜铬细胞瘤中细胞体积较大，呈多边形（Fig 1），胞质丰富，细胞境界不清. 有的为梭形，圆形，椭圆形（Fig 2），常排列成巢状或腺泡状，间质丰富，有毛细血管和血窦. 在部分瘤细胞的胞质中可见深浅不同,粗细不等的棕黄色颗粒物质(Fig 1, 2)， 阳性细胞多为弥散分布，少部分为灶性分布. 23例嗜铬细胞瘤中，阳性者18例，阳性率为78%. 其中良性16例，阳性率为89%；恶性2例，阳性率为40%. Bak在良性嗜铬细胞瘤中的表达显著强于恶性（P＜0.05）.

图1良性嗜铬细胞瘤中Bak阳性的瘤细胞，胞质内可见棕黄色颗粒样物质

fig 1The Bak positive tumor cells of benign pheochromocytoma with yellow-brown granules in the plasma (SABC method, hemotoxylin counter staining)×400

图2恶性嗜铬细胞瘤中Bak阳性的瘤细胞，胞质内可见棕黄色阳性反应物质

fig 2The Bak positive tumor cells of malignant pheochromocytoma with yellow-brown positive products in the plasma (SABC method, hemotoxylin counter staining)×400

3讨论

Bak作为Bcl-2家族的一个新成员，其基因产物主要是加速细胞的死亡，其发挥促凋亡的作用可能是直接激活凋亡途径，也有人认为是其与Bcl-xl或 Bcl-2相结合形成二聚体，发挥促凋亡作用，故Bak常常同Bax一样，列为Bcl-2家族中促进细胞凋亡的成员之一^［1］. 但在EB病毒转染的细胞系中，Bak能阻止细胞死亡，而且在一些长寿命、终末分化的细胞中表达^［2］,故Bak可能在不同的情况或不同的组织中对凋亡有不同的调控^［1］.

本实验表明Bak在正常肾上腺髓质不表达，而在嗜铬细胞瘤中表达（阳性率78%），且Bak在良性肿瘤中表达的阳性率显著高于恶性肿瘤，提示Bak可能与嗜铬细胞瘤的发生有关，并参与嗜铬细胞瘤的凋亡调控. 肿瘤的发生不仅是细胞增殖的结果，也可能是由于细胞凋亡的减少^［3］. 如果认为Bak促进细胞凋亡，则本实验所表明的现象，可能是肿瘤因素的刺激下，细胞发生增殖，反馈性地刺激了机体中促进细胞死亡的相关基因表达，如bak，使细胞凋亡增多，从而试图使机体达到内在的平衡和稳定. 而恶性肿瘤中Bak表达弱于良性肿瘤，可能是机体对恶性肿瘤反馈刺激的反应减弱，从而Bak表达减弱. 当然最终细胞的增殖胜过了细胞的凋亡，肿瘤得以发生发展^［4］. 本实验所揭示的现象也有可能是由于组织特异性的差别，Bak不促进细胞的凋亡，而是延长细胞的寿命^［2］，它在正常髓质不表达，而在嗜铬细胞瘤中表达，使细胞寿命延长，凋亡减少，从而肿瘤发生. 而恶性程度愈高，细胞发生凋亡也愈多，则Bak表达相应减少，当然细胞增殖仍占上风，肿瘤得以发生. 众所周知Bcl-2家族中除Bak外，还有许多成员，它们之间相互作用，通过形成同源或异源二聚体，或直接调控细胞凋亡^［5］. 除Bcl-2家族外，尚有其它许多凋亡相关基因，如p53，c-myc^［5,6］. 故对肾上腺嗜铬细胞瘤的发生以及Bak在其中的表达机制，尚待研究.

本实验还表明Bak在良恶性嗜铬细胞瘤中有不同程度的表达，这有可能成为鉴别良恶性嗜铬细胞瘤的手段之一. 恶性嗜铬细胞瘤只占本病的8%，其诊断依据是瘤组织浸润包膜或临近组织，或发生转移，仅凭组织形态往往与良性者难以区分，而本实验所表明的Bak在良性肿瘤中表达强于恶性，有可能对良恶性嗜铬细胞瘤的鉴别诊断有一定的意义， 但样本太小， 有待深入研究.

作者简介：朱翔，女，1973-05-06生，江苏省南京市人，汉族. 1996年南京铁道医学院毕业，第四军医大学病理学硕士，导师李青. 电话:（029）3374541

作者单位：朱翔李青王文亮第四军医大学:基础部病理学教研室，陕西 西安 710033孙力赵宏喜张献志第四军医大学:第二学员大队，陕西 西安 710033

参考文献

1 Kiefer MC, Brauer MJ, Powers VC et al. Modulation of apoptosis by the widely distributed Bcl-2 homologue Bak. Nature,1995;374(20):736-739

2 Krajewski S, Krajewska M, Reed JC et al. Immunohistochemical analysis of in vivo patterns of Bak expression, a proapoptotic member of the Bcl-2 family. Cancer Res,1996;56(15):2849-2855

3 Reed JC. Mini-Review: Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol,1994;24(1):1-6

4 Chittenden T, Harrington EA, Connor RO et al. Induction of apoptosis by the Bcl-2 homologue Bak. Nature,1995;374(20):733-736

5 皋岚湘，丁华野. bcl-2基因与恶性肿瘤. 国外医学生理、病理科学与临床分册,1996;16(2)：69-72

6 Wang DG, Johnson CF, Marley JJ et al. Expression of the apoptosis-suppressing gene bcl-2 in pheochromocytoma is associated with the expression of C-MYC. J Clin Endocrinol Metab, 1997;82(6):1949-1952