国外医学免疫学分册1997年第20卷第3期

中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所（北京 100021）

徐先发施一江（综述）唐平章黄常志（审校）

摘要热休克蛋白是生物细胞在受到各种理化因子刺激下产生的一类高度保守的蛋白质，具有“分子伴侣”作用。HSP与肿瘤细胞的增殖密切相关。HSPs-肽复合物通过活化体内多个CTL克隆，可望特异杀伤同一种肿瘤内所有肿瘤细胞，打破免疫耐受，消灭残存瘤组织，克服目前肿瘤免疫治疗中难以解决的抗原多变性及细胞异质性等困难。HSP70反义RNA通过阻断肿瘤细胞HSP70的表达抑制肿瘤细胞增生，诱导肿瘤细胞调亡亦为肿瘤的基因治疗提供了新的途径。

关键词：热休克蛋白肿瘤

生物细胞在受到各种理化因素（如乙醇、病毒感染、氨基酸类似物、缺氧、重金属离子等）刺激后，发生应激反应，诱导一类新的基因合成热休克蛋白（heat shock protein，HSP）。这一现象又被称为热休克应答（heat shock response）^[1，2]。HSP广泛存在于原核和真核生物，是一类高度保守的蛋白质。HSP的主要功能是在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质以维持细胞的生存。HSP与具有不同功能的多种蛋白质在细胞中形成复合体，并通过其形成和解离而参与有关蛋白的折叠、亚基的组成，细胞内运输及降解等过程，从而调节靶蛋白的活性和功能，但又不参与靶蛋白的组成。因此，HSP又被认为是“分子伴侣”^[3]（molecular chaperone）。近年来发现，HSP通过与原癌基因和抑癌基因及其蛋白产物的相互作用调节肿瘤细胞的增殖。在肿瘤细胞中，一些HSP家庭成员表达增强。HSP可在体内诱导多个肿瘤特异的细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性，特异杀伤肿瘤细胞，具有肿瘤疫苗的作用，因此，HSP已成为医学上的研究热点。

【HSP家族的组成、结构和功能】HSP通常依其分子量的大小和同源程度分为HSP90、HSP70、小分子HSP及泛素等几个家庭^[4]。在脊椎动物，HSP90家族由不同的基因家族编码的几种不同形式组成，常见的有HSP90、HSP83、gP96等。序列分析表明，几乎所有的真核细胞HSP90的羧基末端有一小的富含负电荷区域，虽然序列变化较大，但最末端4个氨基酸均为glu-glu-val-asp。这一区域的电荷分配与DNA双螺旋中磷酸基团相似，也就决定了HSP90家族与激素受体、癌基因产物之间的调节关系。

人HSP90以是否含有丰富的谷氨酰胺片段而分为HSP90α和HSP90β两类。两者分别由730和724个氨基酸组成，其同源性为84%。氨基酸序列的主要差别在于HSP90α的氨基酸末端有一五氨基序列（QTQDQ），而HSP90β无此序列。HSP90家族是一类可溶性蛋白，有极高的保守性。它们能特异地与多种细胞功能蛋白（如逆转录蛋白、甾体激素受体、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等）结合而改变这些蛋白的功能状态。HSP70家族在细胞内含量最多，是由位于细胞内不同部位数量很多的成员组成。真核生物的HSP70具有高度的保守性。HSP70分子的氨基端部分具有ATP结合区和ATPase活性，比羧基端部分具有更高的保守性，推测羧基端部分可能与一系列特殊蛋白底物作用，氨基端部分与所有HSP70共同的生化性质有关。多年研究发现，HSP70家族具有许多共同的性质：①所有的HSP70与ATP的结合具有亲合力，并具有ATPase的活性；②识别不同的靶多肽并调节它们的构象；③在行使功能时需要其它的HSP或细胞因子辅助；④在细胞内异常蛋白的积累可以诱导HSP70爱族成员合成；⑤参与c-myc,c-fos和P₅₃等原癌基因和抑癌基因及其蛋白产物的相互作用而调节细胞的增殖。小分子HSP多种多样，分子量在16～40kD之间，人类HSP27是由132～186个氨基酸组成^[5]，其羧基端氨基酸排列非常相似，具有亲水性。小分子HSP在进化上不如HSP70保守，但分布却很广泛，其功能目前不很清楚。对HSP27的转基因研究表明，它与热耐受和多药耐药^[6]（MDR）有关。

【HSP和原癌基因及抑癌基因的相互作用】第一个发现原癌基因和HSP90相互作用的是pp60v-src。在pp60v-src合成结束后，便立即与HSP90结合。此时它不能自身磷酸化，也不能对其底物磷酸化。一旦与HSP90解离，便具有酪氨酸激酶活性。进一步研究发现，温度敏感的突变型pp60v-src ，在非允许温度下，与HSP90结合，失去激酶活性，存在于胞浆内。在适宜温度时，与HSP90分离，表现出很高的酶活性，并定位在细胞膜上^[7]。其它转化蛋白如yes,fps,fes,fgr也陆续发现能与HSP90结合形成复合体，并转运到细胞内特定位点，使其不能装配成有活性的酪氨酸激酶^[8]。有文献报道，氨基酸激酶抑制剂格尔德霉素（GA）和HerbimycinA（HA）具有使肿瘤细胞逆转的作用，其作用机理不是直接抑制这类激酶的活性，而是与HSP90结合，破坏HSP90-pp60v-src复合体的形成，使pp60v-src不能装配成活性状态的功能蛋白和转运到特定的位点从而失去转化功能^[7]。

HSP90通过构象的特异性与突变型P₅₃结合，导致突变型P₅₃复合体的积聚，半衰期延长，而HSP70在转录后水平选择性地与突变型P₅₃结合能促进复合体的形成^[9]。Rb在有丝分裂时和应激后与HSP75（HSP90家族成员之一）结合，对Rb的构象和功能的调节有重要意义^[10]。人HSP70启动子和c-fos启动子在一些片段具有同源性，它们可能同时受神经生长因子的调节^[11]。c-myc基因产物能促进HSP70基因的表达，人c-myc蛋白与HSP70结合具有两个特异位点。运用抗人c-myc蛋白的单抗，c-myc蛋白复合物便不能与这两个特异位点结合^[12]。

【HSP在肿瘤中的诱导表达】肿瘤的发生是一多因素多步骤的过程，最突出的表现是肿瘤细胞具有无限增殖能力。肿瘤细胞的不断增殖需要大量的HSP作为“分子伴侣”来调节和稳定这一异常增殖过程。正常细胞中，HSP90是受细胞周期调控的，但在肿瘤细胞中，HSP90呈持续的高诱导表达是不需要应激的，突变的或不正常的蛋白质的存在刺激了HSP90的合成。在病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中，HSP90α的表达比正常细胞高2～10倍。如腺病毒E1A基因产物诱导Hela细胞增殖时，HSP90α在诱导分化后表达下降，而HSP90β无变化。在许多肿瘤细胞中HSP90α表达异常。Thomas^[13]研究发现，胰腺癌与正常胰腺和慢性胰腺炎组织相比，HSP90α呈选择性高表达。HSP70mRNA的水平也有所提高，且HSP70的表达和TGF-β1的表达有很强的相关性。在急性白血病细胞中，HSP90mRNA表达水平增高，诱导分化后HSP90表达明显被抑制^[14]。在乳腺癌中，HSP90高表达往往预示着差的预后^[15]。

HSP70、HSP27与肿瘤关系密切。HSP70可保护WEHI-S肿瘤细胞免受TNF介导的单核细胞的细胞毒作用，且HSP70和HSP27也能抵抗非TNF介导，可能是由自由基介导的单核细胞的细胞溶解作用^[16]。在许多亚性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、白血病、神经母细胞瘤等，HSP70与HSP27都有高表达，且表达的量与恶性程度相关。如在原位乳腺癌，有HSP27高表达的病人较无HSP27表达的无瘤生存期短^[17]。在卵巢癌，对HSP70的研究也发现同样结果，HSP70可作为卵巢癌预后一个有价值的因素^[18]。免疫组化分析发现分化差的口腔鳞癌HSP70表达更高，但不足以作为口腔鳞癌恶性程度的肯定标志^[19]。在神经母细胞瘤细胞系，当用维甲酸诱导分化时，HSP27表达上升；当有c-myc基因扩增时，HSP27表达下降^[20，21]。

【HSP在肿瘤治疗中的研究】HSP不仅参与蛋白的运输、解聚以及保护细胞免受环境压力。很多研究还表明，HSP在参与肿瘤免疫中发挥着重要作用。有关HSP参与肿瘤的特异免疫的研究以Svivastava等对MCA诱导的BALB/C小鼠肉瘤MethA，CMS5和CMS13中的HSP70、HSP90和gp96的特异免疫诱导作用的研究为代表^[22]。分别从MethA，CMS5和CMS13中提取HSP70，HSP90和gp96，用其分别免疫BALB/C小鼠，被免疫小鼠产生了抗相应HSP来源细胞株之活细胞移植的能力，对照组正常组织来源的HSP不能诱导机体产生这种抗肿瘤移植能力。HSP诱导的免疫具有很强的特异性。进一步研究表明，HSP这种特异的免疫原性，不是由HSP本身，而由与HSP结合的多肽复合体抗原引起的^[23，24]。从肿瘤组织中提取的HSP事实上是结合了不同抗原多肽的HSP，是多种HSPs-肽复合物。

HSPs-肽复合物诱导机体特异性免疫反应尚处在探索阶段。其作用机理仍不十分清楚。Suto^[25]对转染病毒基因细胞的gp96的免疫诱导作用机制研究初步提示了HSPs-肽复合物免疫诱导机制。已知CTL的活化在肿瘤免疫中起着重要作用，而HSP与抗原肽的结合构成了CTL活化的关键步骤。HSPs-肽复合物对CTL的诱导需巨噬细胞（M φ）的参与。在体外用识别疱疹性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）的特异CTL识别表位VSV8与gp96构建gp96-VSV8复合物，分别用构建的复合物和单纯VSV8与M孵育，复合物组的Mφ获得了是单纯VSV8组中Mφ的200～400倍的刺激特异CTL能力；含VSV8的较长肽段在体外不能通过Mφ刺激CTL，而与gp96构成gp96-肽复合物后，获得了几乎与VSV8-gp96复合物一样的刺激CTL的能力（通过Mφ），表明gp96-肽复合物具有较强的活化CTL的能力，这种作用是单纯肽的数百倍。用两种不同单倍型（H-2^b，H-2^d）MethA肉瘤中gp96分别免疫H-2^b鼠，均可使其产生H-2^b鼠MethA的特异CTL。提示HSPs-肽复合物免疫诱导作用在同种内不受MHCI类抗原限制。现已清楚，人类肿<