第三军医大学学报1999年第21卷第10期

王征旭何振平吴祖泽马宽生刘吉奎张维维

提要目的：研究腺病毒介导的多基因(GM-CSF、B7-1、p53、IL-2)在胆管癌细胞系QBC939中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含GM-CSF、B7-1、p53、IL-2 4种目的基因的重组腺病毒载体Ad-multigenes,应用流式细胞仪、ELISA、免疫组化等方法，分析该重组腺病毒体包含的目的基因在靶细胞中的表达，并绘制细胞的生长曲线。结果：腺病毒介导的多基因在胆管癌细胞系QBC939中高效表达(IL-2不表达)，并能抑制胆管癌细胞的生长。结论：腺病毒介导的多种基因能在胆管癌细胞QBC939中表达，并抑制肿瘤细胞的生长。

关键词：多基因腺病毒 胆管癌细胞系 基因表达 生长抑制

由于人们目前对肿瘤发病机制和免疫逃避机制认识的局限性，尚无公认的肿瘤基因治疗模式^［1］。在肿瘤基因治疗中既要考虑导入的目的基因对肿瘤细胞生长的抑制或诱导细胞凋亡的作用，又要考虑到有利于提高肿瘤细胞的免疫原性，从而调动和增强机体对肿瘤的免疫能力。从这一目的出发，本文以E1、E3区缺失的血清5型腺病毒为载体，构建了同时含人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因的重组腺病毒载体，研究该腺病毒体在胆管癌细胞系中的表达和对其生长的影响。

1材料与方法

1.1构建复制缺陷型重组腺病毒载体

分别构建重组质粒，包含：①p53/GM-CSF表达框：含CMV始动子、野生型人p53 cDNA、EMC-IRES(脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点)^［2］、人GM-CSF cDNA和SV40聚腺苷酸化信号；②B7-1/IL-2表达框：含人SV40早期始动子、人B7-1 cDNA、EMC-IRES、人IL-2 cDNA、BHG聚腺苷酸化信号。将2个表达框分别克隆到质粒pXCJL1(长7.0 kb)上，形成同时含p53、GM-CSF、B7-1、IL-2的表达载体。该表达载体再与重组质粒pJM17(长40.3 kb)形成同源重组，以脂质体DOTAP(Promega)介导，共转染进入293细胞，通过PCR法筛选、鉴定，得到含4个目的基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-multi-genes，见图1。含绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)^［3］基因的重组腺病毒载体Ad-GFP，作为对照，导入该重组腺病毒体的靶细胞，在荧光显微镜下呈绿色。

1含绿色荧光蛋白基因和多基因的复制缺陷型重组腺病毒体结构示意图

Fig 1Structural analysis for replication-incompetent adenoviral gene therapy vectors encoding GFP(Ad-GFP),B7-1 and IL-2 and p53 and GM-CSF(Ad-multigenes)

1.2细胞培养及主要试剂

胆管癌细胞系QBC939由本科王曙光博士建立并惠赠。含5型腺病毒E1片段的人胚肾细胞系293细胞，由美国Baxter医疗用品公司提供。以上细胞均培养于含10%胎牛血清(中国医学科学院血液制品研究所)的高糖型DMEM(GIBCO BRL)中，并补加HEPES、谷胺酰氨、青链酶素等。定量检测IL-2、GM-CSF的ELISA试剂盒购自Genzyme公司；FITC标记的B7-1(CD80)鼠抗人单克隆抗体购自Pharmingen;p53鼠抗人单克隆抗体(PAb1801)购自Pharmingen；低熔点琼脂糖(用于空斑实验)购自Sigma公司；氯化铯购自GIBCO公司。

1.3腺病毒的扩增、纯化、滴度测定

当培养的293细胞达到90%融合时，给予10 MOI纯化的腺病毒，或5ml含腺病毒的培养上清，培养36～48 h，当细胞致病变效应(CPE)达90%～100%时(细胞变圆、间隙加大，10%～20%细胞脱落)，收集细胞存-80°C。收集的293细胞经反复冻融3次，离心去掉细胞碎片，上清用氯化铯密度梯度离心法，150000×g，10°C离心1h，收集病毒带，再次用氯化铯密度梯度离心法，10°C，150000×g离心18 h，收集病毒带，用含10%甘油的Hank's液透析病毒24 h，用病毒的空斑实验(Plague assay)，进行病毒的滴度测定。

1.4胆管癌细胞系对腺病毒感染效率的检验

QBC939细胞以1×10⁴/孔接种于24孔板，12 h后感染不同MOI的Ad-GFP,48 h后在荧光倒置显微镜(OLYMPUS IX-70)下计数发绿色荧光的细胞和该视野的全部细胞数。

1.5检测目的基因在胆管癌细胞中的表达

60 mm平皿接种5×10⁵细胞，12 h后感染50 MOI的Ad-multigenes，每24 h换1 ml新鲜培养液，收集上清用于ELISA法检测IL-2、GM-CSF的表达量；1×10⁶细胞接种60 mm平皿，感染重组腺病毒48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，FITC标记的B7-1(CD80)鼠抗人单克隆抗体与靶细胞在室温共同孵育30 min，Hanks液洗3遍，用于流式细胞仪(B&D公司)检测B7-1的表达，计数细胞量为15000个；2×10⁵细胞接种60 mm平皿，感染病毒后48 h，用免疫组化法检测p53蛋白的表达。

1.6绘制细胞生长曲线

QBC939细胞以2×10⁵数量接种于60 mm平皿，第2天感染50 MOI的Ad-multigenes或Ad-GFP，培养基作对照，每皿重复3次，于感染后的不同时间收集细胞，台盼蓝染色，细胞计数，每皿重复3次。

2结果

2.1高滴度重组腺病毒体的制备和胆管癌细胞系对腺病毒的感染效率

经氯化铯密度梯度超速离心，获得高度浓缩的、高纯度的重组腺病毒，其OD₂₆₀∶OD₂₈₀＞1.3。经空斑实验，该重组腺病毒体的滴度是：Ad-multigenes为2×10¹⁰pfu/ml，Ad-p53为2×10¹¹ pfu/ml，Ad-GFP为9×10¹⁰ pfu/ml。给予50 MOI的Ad-GFP时，胆管癌细胞系QBC939可达到80%左右的感染效率。同时感染人肝脏原代培养成纤维细胞，见图2。多个肝细胞癌细胞系和大鼠癌肉瘤Walker 256细胞，感染50 MOI的病毒量时，均可达到80%～90%左右的转染效率。

图2QBC939(左)和肝原代培养成纤维细胞(右)导入50 MOI Ad-GFP后24 h(×200)

Fig 2QBC939 cell(left) and primarily cultured hepatic fibroblast (right) infected 24 h after with 50MOI Ad-GFP(×200)

2.2腺病毒介导的多基因在QBC939细胞中的表达

胆管癌细胞系感染50 MOI的Ad-multigenes后，1×10⁶细胞每24 h最高可表达约16 ng GM-CSF。转导20 MOI的Ad-multigenes后48 h，FACS检测B7-1的表达水平，胆管细胞癌增加约6倍左右。以大鼠Warker 256细胞做为表达人B7-1蛋白的阴性对照，可见QBC939细胞弱表达B7-1分子，见图3，随感染病毒量的增加，B7-1的表达水平亦增加。

图3QBC939细胞导入多基因后48 h FACS分析B7-1的表达

a：Walker 256细胞系；B：Walker 256细胞系(……)和QBC939细胞系(-)；C：QBC939细胞系转导20 MOI Ad-multigenes;D：QBC939细胞系转导50 MOI Ad-multigenes

Fig 3FACS analysis of B7-1 expression of QBC939 cells

48 h after transduced with Ad-multigenes

A：Walker 256 cell line; B：Walker 256 cell line(……) and QBC939 cell line (-); C：QBC939 cell line transduced with 20 MOI Ad-multigenes; D：QBC939 cell line transduced with 50 MOI Ad-multigenes

IL-2的表达水平在ELISA试剂盒检测值的下限以下。

2.3细胞生长动力学改变

胆管癌细胞系QBC939感染50 MOI的Ad-multigenes后，与亲本瘤相比，细胞生长受到不同程度的抑制，见图4，而感染50 MOI对照病毒Ad-GFP后，细胞生长则不受影响。

4导入多基因后QBC939细胞生长曲线改变

fig 4The growth curve of QBC939 cells after

transduced with Ad-multigenes

3讨论

因同一肿瘤类型的不同个体，其发生肿瘤免疫逃逸的机制可能并不相同，故使用一个基因进行肿瘤的基因治疗，其应用范围会十分局限。当今国际上肿瘤基因治疗的发展趋势是多基因协同，进行联合基因治疗。

我们将4种目的基因构建在同一个腺病毒载体上，可保证