中华肿瘤杂志CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY

1999年第21卷第4期VOL.21NO.41999

王申五武莎莎

关键词：凋亡 肿瘤 诱导

多细胞机体，包括人，均存在着细胞增殖与死亡的平衡，以维持机体的稳态(homeostasis)，二者是一个矛盾的两个方面，此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。肿瘤学家传统关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞，如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力，是他们首先考虑的问题。然而，机体还存在另一普遍现象，即死亡。细胞的死亡有两种形式，一种是病理性死亡，称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物，使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡——凋亡(apoptosis)，又称程序性死亡(programmed cell death)。1972年Kerr等人对凋亡细胞的超微结构变化做了详细的描述，凋亡早期细胞核固缩、边缘化、胞浆浓缩；晚期核片段化，被膜包裹、隆起，产生凋亡小体，最后被巨噬细胞吞噬，在溶酶体内降解。因此，凋亡不造成周围组织的炎症反应。凋亡细胞这些形态上的特殊改变是它与正常和坏死细胞区别的依据。凋亡细胞还有其特有的生化改变，包括：(1)Ca²⁺活化胞浆蛋白酶，称为ICE(interleukin-β converting enzyme)家族，最近命名为capases，即含半胱氨酸的门冬氨酸特异的蛋白酶，已发现至少10种，参与凋亡的级联反应，例如caspase-3，称为CPP32/YAMA/apopain，可降解DNA修复有关的酶PARP［poly(ADP-ribose)聚合酶］。(2)细胞内Ca²⁺增高，活化核酸内切酶，切割染色体以核小体DNA(约200 bp)为单位的DNA片段，此切割是非随机的，它与坏死时DNA随机降解有明显的不同。(3)与胞浆蛋白质交联有关的转谷氨酰胺酶活性的增加。(4)细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸外翻至膜外，从而有利于巨噬细胞的识别和吞噬。凋亡细胞的核、胞浆及膜上的这些化学变化是测定凋亡和解释调亡现象的分子基础。我们从凋亡与肿瘤的发生、化疗、放疗，肿瘤细胞凋亡的相关基因以及肿瘤治疗的几个新靶点等方面对肿瘤与凋亡的关系加以论述

一、凋亡与肿瘤的发生

肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。未经治疗的恶性肿瘤有细胞凋亡发生。1972年Kerr等人在提出凋亡概念的同时预测：恶性肿瘤中的自发凋亡可能会涉及到导致肿瘤消退的治疗作用。这种自发凋亡的常见原因有3个。(1)肿瘤组织内部接近融合灶部位的缺血、缺氧所激发的凋亡。(2)肿瘤组织内部渗出性的巨噬细胞释放TNFα，TNFα结合TNF-R1激活caspase-3途径引起凋亡。(3)细胞毒T-淋巴细胞(CTL)攻击载有靶抗原的肿瘤细胞引起凋亡，这是经颗粒酶β(granzyme β)激活caspases途径而发生。肿瘤细胞中的自发凋亡是机体抗肿瘤的一种保护机制，是细胞受损后机体将有害细胞清除的生理途径。

二、抗肿瘤治疗中的诱导凋亡

尽管凋亡是细胞死亡的一种生理途径，但它仍可以被各种病理性刺激引起。一般说来，任何直接破坏造成细胞坏死的因素，在细胞的存活阶段都有凋亡的发生。从这个意义上讲，细胞凋亡体现了细胞对那些不能立即引起致死的有害刺激的一种调节作用。

(一)肿瘤化疗诱导凋亡：大多数抗癌药物都能引起其敏感细胞的凋亡，这些药物包括DNA复制抑制剂、抗代谢剂、拓朴异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂以及酪氨酸蛋白酶抑制剂等。砷化物在低浓度时可引起淋巴细胞凋亡，高浓度则引起它们坏死。对化疗诱导凋亡的敏感细胞有：淋巴瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、混合型腺癌、神经胶质瘤等细胞。化疗诱导肿瘤细胞的凋亡也已在体内发现：全反式维甲酸既诱导血细胞分化又诱导其凋亡，5-Fu、顺铂、博来霉素治疗食管癌，环磷酰胺治疗乳腺癌和卵巢癌，VP16、m-AMSA、阿糖胞苷治疗急性白血病等。化疗对肿瘤产生的效果不仅仅依赖于与特异的生化靶分子的相互作用，也依赖于引起肿瘤细胞的凋亡。化疗诱导肿瘤细胞的凋亡需要有caspases参与，反义的caspase 1和3强烈抑制药物诱导的凋亡。肿瘤对化疗的抗性机制有多种解释，主要是多药耐药，包括P 170糖蛋白和多药耐药相关蛋白(MDRP)等。对诱导凋亡的抗性是多药耐药产生的一个新机制。不同肿瘤细胞对化疗的反应不同，主要是因各种细胞对凋亡的阈值不同，对化疗剂有抗性的肿瘤实质上是不能活化其凋亡途径。由这个认识出发，建立一种治疗前定量测量患者肿瘤细胞对化疗剂致凋亡的反应性和阈值的方法，将对临床医生制定化疗方案有一定意义。为此，我们介绍几种定量检测细胞凋亡的方法。

1.DNA片段化的定量。包括分离胞浆片段化DNA的定量和以流式细胞仪(FACS)分析细胞的亚二倍体峰。由于后者可能混有坏死的DNA片段，我们主张同时计数台盼蓝拒染的活细胞百分数加以校正(凋亡细胞拒染，坏死细胞着色)。

2.抗组蛋白抗体经Elisa测定胞浆核小体。

3.PARP的Western印迹法测定凋亡的早期事件。113 000的PARP降解为89 000及24 000的片段，这是凋亡蛋白酶caspase-3/CPP 32的作用所致。

4.膜联蛋白-5(annexin-5)荧光法。以FACS直接分析凋亡与坏死，这是因膜内的磷脂酰丝氨酸在凋亡时转至膜外而被标记。

5.原位细胞死亡测定(TdT-mediated dUTP-Xnick end labeling, TUNEL)。这是基于核酸内切酶将DNA链切出缺口的原理。

(二)肿瘤放疗诱导凋亡：放射治疗癌瘤使之发生萎缩的过程中，凋亡起着重要的作用，示踪剂量的辐射可使淋巴瘤细胞发生凋亡。造血细胞对射线诱导的凋亡很敏感，少至1 Gy的γ-射线就可导致休止的B和T细胞全部凋亡。放疗诱导凋亡的程度因肿瘤不同而异，对有些肿瘤细胞不仅仅是通过损伤DNA使基因失活而起作用，还通过活化凋亡过程杀死肿瘤细胞。放疗诱导凋亡是由p53基因调控的。p53缺陷小鼠不能被离子幅射诱导凋亡。DNA的损伤无论是在链水平还是碱基水平都足以使p53表达水平增高并诱导凋亡。

(三)其他凋亡诱导剂：

1.高热：在敏感的组织中，43℃ 30分钟就引起广泛的细胞凋亡，热至46℃以上，30分钟即引起坏死。对热诱导凋亡敏感的组织与放、化疗相似，例如那些快速增殖的正常细胞、淋巴样器官和肿瘤，肿瘤对热诱导凋亡的敏感程度因瘤而异。

2.激素诱导凋亡：去除滋养性激素的刺激后，依赖于内分泌调节的器官，如前列腺和肾上腺皮质就会因凋亡而萎缩，而依赖于激素的肿瘤的去激素治疗将会增加肿瘤的凋亡。相反，增加糖皮质激素的水平可以诱导淋巴性白血病和淋巴瘤细胞的凋亡，而bcl-2表达的增高则与一些淋巴细胞株抗糖皮质激素诱导的凋亡有关。

3.APO-1/Fas抗体诱导凋亡：一种APO-1抗体能诱导活化的T及B淋巴细胞凋亡，也能诱导人白血病细胞株的凋亡。给小鼠移植表达APO-1的人白血病细胞株，注射抗APO-1单抗能引起大量的移植细胞凋亡，移植物很快消退。

4.细胞毒淋巴细胞诱导凋亡：体外研究证明，细胞毒T细胞和自然杀伤细胞引起靶细胞的死亡是典型的凋亡，体内异基因移植细胞的免疫排斥反应也引起细胞凋亡，细胞毒性T细胞消除病毒感染细胞同样是通过凋亡，此途径在肿瘤的细胞免疫治疗中起着重要作用。

5.IFN-γ活化STAT-1(signal transducer and activator of transcription)，诱导caspase 1表达增加，引起凋亡。

三、凋亡受肿瘤主基因调控

人类肿瘤凋亡有3个主基因(master genes)：p53、bcl-2和c-myc。Bcl-2基因是一种抗凋亡基因，它防止肿瘤细胞因各种因素引起的凋亡，因此与肿瘤的放、化疗抗性有关。野生型p53是肿瘤抑癌基因，它与细胞的生长阻滞和凋亡有关，因此它能促进放、化疗剂的杀伤作用。肿瘤细胞受到放疗、化疗后，受损细胞启动一个转录信号使p53表达增加，引起细胞G₁期阻滞以完成修复，或进入凋亡以清除受损细胞。所以p53基因是促凋亡基因，野生型p53蛋白被称为“分子卫兵”，对机体起保护作用。c-myc是典型的原癌基因，在许多肿瘤中它有多种失活形式。c-myc的表达驱动细胞凋亡，这与细胞所处的条件有关。bcl-2能妨碍依赖p53的凋亡，但不影响依赖p53的生长停滞，可是将bcl-2与c-myc共表达时这两者都被阻断。一个主要显性癌基因c-myc与一个抗凋亡基因bcl-2的协同作用会导致肿瘤向恶性表型进展，并对肿瘤治疗的抗性增加，而p53和bcl-2间的相互拮抗作用则有利于抗肿瘤治疗。似乎此3个肿瘤凋亡主基因的平衡支配着人类肿瘤的预后，然而我们不能忽视其他基因的作用，例如那些不依赖于p53引起凋亡的基因。

四、凋亡与肿瘤治疗的几个新靶点

p53基因的突变以及Bcl-2的表达增高会对人类肿瘤的治疗产生抗性。这是由于p53的突变使它们失去了依赖野生型p53的凋亡，而bcl-2蛋白则在抗凋亡中起主要作用，这两者常会使治疗失败。从这一机制出发，改变肿瘤的抗凋亡状态，将具有临床的实用价值。

1.增加诱导凋亡基因的表达。将野生型p53基因导入人头颈部鳞癌细胞株，体内外都有抑制生长的作用。我们将野生型p53经逆转录病毒转导至白血病细胞株，增加了它对紫外线照射引起凋亡的敏感性，以同样的p53病毒感染CML患者的骨髓细胞促进了它的凋亡。这些实验证据提供了白血病基因治疗的良好前景。

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