【中图号】R454.5

为了制定安全合理的介入性热化疗方案,我们采用MTT比色法在体外研究了临术常用的阿霉素(ADM)与热疗结合对兔VX-2细胞作用的最佳温度,最佳加热时间,及最佳组织方式,现报告如下。

1材 料 与 方法

1.1细胞培养

免VX-2由本校实验动物中心提供,按常规方法培养于含体积分数为10%的小牛血清的RPMI-1640全培养液中〔含青霉素(PC)100 U/ml,链霉素(SM) 100 μg/ml〕,单层培养于37 ℃ CO₂恒温孵育箱内,用接种传代第三天的细胞(处于对数生长期)做实验。

1.2加热处理

设37 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃等六个温度点。采用水浴加热法,(数字式恒温浴槽,温差≤±0.1℃),将培养瓶浸没于水中,加热时间设0,15,30,60 min共四组。

1.3药物处理

阿霉素(ADM),设0,1,2,4,8,16,32,64 μg/ml等共八组,用微量进样器加药。

1.4加热化疗顺序

先化后热(先化疗1小时再热疗),热化同时(加药同时加热化疗1小时),先热后化(先加热后化疗1小时)。

1.5实验分组设计

按不同温度,不同加热时间,不同热化顺序和不同药物浓度四个因素设计,即组内分组设计,化疗时间统一为1小时,将实验处理过的细胞消化成细胞悬液(5×10⁵个细胞/ml)接种到96孔板上,设三个复孔,每孔200μl(1×10⁵个细胞/ml),以未经处理的细胞为阴性对照,以不含细胞的1640全培养液为空白对照,常规法孵育24 h后每孔加入MTT50 μl,继续培养4～6 h,去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)100μl/孔,充分振荡5min,上酶联免疫检测仪,测定λ＝490 nmy时每孔的吸光度值(A),计算细胞毒指数(CI):

CI值＝(1-实验孔的平均A值/阴性对照孔的平均A值)×100%

1.6统计学处理

方差分析,Q检验。

2结果

2.1单纯热疗的细胞毒作用

42 ℃ 30min以下较弱;43 ℃30 min以上较强;44℃ 60 min CI值接近100%;低于41℃ 30 min同37 ℃没有明显差别。

2.2单纯化疗的细胞毒作用

常温37 ℃ 2 μg/ml以下较弱;超过2 μg/ml,随着浓度提高,CI值明显增加,32μg/ml,CI值30 min接近100%。

2.3热疗和化疗联合的细胞毒作用

随着温度提高,CI值增大,曲线上移,42 ℃以上显著;随着热疗时间延长,CI值亦增大,曲线上移,30分钟以上显著。随着温度升高和时间延长,取得相同CI值所需药物浓度降低。提示浓度、温度、时间之间有一定关系。

2.4热疗与化疗顺序的影响

同一浓度和温度下,顺序不同,CI值有所不同。同一温度下,4～16μg/ml间,先化后热与热化同时有显著性差异(P＜0.05),两者与先热后化间亦有显著性差异(P＜0.01),但2μg/ml以下及32 μg/ml以上差异不显著(P＜0.05)。同一浓度(8 μg/ml)下,42～43℃间,结果同上,但41 ℃以下和44 ℃以上差异不显著(P＞0.05)。

3讨论

3.1ADM对热疗具有增效作用

ADM是S期特异性药物,主要作用机制是在DNA复制过程中诱导TOPOⅡ抑制剂-DNA断裂物复合物的形成,引起细胞死亡或停滞于S期。由于ADM使大量细胞处于S期,S期对热最敏感,因此先化后热毒性作用较强,是化疗对热疗的增效作用。

3.2高热对细胞具有毒性作用

高热对细胞膜具有独特作用,可改变生物膜的流动性,导致原发的细胞浆破坏;高热能抑制细胞DNA、RNA、蛋白质的合成与修复;高热可以改变细胞膜的通透性,提高胞浆中的药物浓度;细胞有丝分裂S期的细胞对热亦敏感,慢性乏氧细胞对热最敏感;42℃时可引起蛋白质和DNA变性称热变性。但温热必须达到一定温度对细胞才有毒性,乏氧肿瘤细胞比正常组织细胞对热更敏感。本实验中看出单纯热疗43℃ 30 min以上毒性较强,而超过44 ℃VX-2细胞几乎全部死亡,即热变性作用;低于41℃ 30 min弱。因此在体内应用时既要注意温度过高对正常细胞的损伤,又要注意温度不能过低以致影响疗效,介入治疗中要尽可能使导管插到肿瘤靶血管内,使肿瘤局部产生高温。

3.3高热对化疗有增敏作用

42～43 ℃化疗作用明显强于37 ℃化疗。本实验提示浓度、温度、时间之间存在正相关关系。一定范围内,随着温度提高,达到相同CI值所需药物浓度降低,说明高热对化疗具有热增敏作用。低于这一范围,药物的毒性起主要作用,浓度越高作用越强;高于这一范围,热变性起主要作用,温度越高作用越强。

3.4本实验证明

兔VX-2细胞的ADM热化疗,先化后热强于热化同时,后者强于先热后化。不同的药物与热疗联合的最佳顺序不同,如丝裂霉素以热化同时最佳。在本实验中发现ADM与热合用,效果依次为先化后热,热化同时,先热后化,这是由药物的机理决定的。ADM与热疗相互增敏作用机理可能为:①ADM使对热敏感的S期细胞增多;②热疗增加细胞膜的通透性,提高细胞内的药物浓度;③高热使酶的活性受到抑制,障碍DNA的修复。

(收稿1998-05-05修回1998-08-31)