摘要目的探讨胶原降解在肥厚性瘢痕形成中的作用。方法应用原位杂交和SDS-聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳观测了肥厚性瘢痕组织中胶原酶表达、酶活性及胶原的降解。结果肥厚性瘢痕组织中胶原酶表达较正常皮肤略有增加，但酶活性却明显下降，胶原降解减少。结论胶原酶活性降低，胶原降解不足可能是肥厚性瘢痕形成的又一重要原因。

Experimental Study on Expression and Aciticy of Collagenase in Hypertrophic ScarWu Jixiang Wu Zongyao Chen Deying.Department of Physical Medicine & Rehabilitation, Southwest Hospital,400038

AbstractObjectiveTo explore the role of collagen degradation in formation of hypertrophic scar.Methods

The expression and activity of collagenase in hypertrophic scar and normal skin were studied with in situ hybridization and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.ResultsThe expression of collagenase was slightly increased,but its activity was greatly decreased compared with that of normal skin.The collagen degradation in hypertrophic scar was decreased.ConclusionThe decreased collagenase activity and insufficient collagen degradation were another important causes of formation of hypertrophic scar.

Key wordsburns/rehabil;cicatrix/rehabil;clostridiopeptidase A/metab

肥厚性瘢痕(HTS)是皮肤烧伤和创伤愈合后康复的一大难题， 其发生机理仍不清楚，临床上也无确切有效的防治方法^〔1〕。HTS以组织纤维化，胶原合成和降解平衡失调，胶原过度沉积为特征。因此胶原合成过度或降解减少均与HTS 的形成密切相关， 前者已有较多的报道， 但后者的研究极少^{〔 2〕}。胶原酶(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的重要一员， 在启动胶原降解中具有重要的作用。为此本文观察了HTS组织中MMP-1表达与活性，胶原降解的状况，以阐明胶原降解在HTS形成中的作用。

材料与方法

一、标本

HTS 24例，男性16例，女性8例，均为烧伤后半年至二年的瘢痕， 经病理切片证实为HTS，正常皮肤(NS)6例取自外科手术，取材后立即置液氮保存。

二、主要材料

MMP-1质粒由日本Kanarawa大学H.Sato博士惠赠，探针长度为1.5 Kb。地高辛配基标记检测试剂盒购自宝灵曼公司，EcoRI、BamHI、蛋白酶K、 丙烯酰胺购自华美生物公司，Ⅰ型胶原购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

三、方法

1.制备探针：按常规将MMP-1质粒转入大肠杆菌JM109并扩增，碱裂解法大量抽提质粒，透析袋电泳洗脱法制备质粒探针，按药盒说明书标记探针，标记探针置-20℃备用。

2.原位杂交方法:所有标本均做冰冻切片，片厚20 μm，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗10 min×2次，蛋白酶K(100 μg/ml)37℃消化30 min，PBS和2×SSC各漂洗10 min， 入杂交液45℃杂交24 h。杂交后依次用4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5× SSC 和 PBS 各漂洗10 min，再用地高辛－碱性磷酸酶显色。阳性杂交信号为蓝紫色。阴性对照(杂交液中不含探针)无色。

3. HTS和NS MMP-1的提取:按Agren^〔3〕的方法提取MMP-1。HTS和NS各3 g，切碎后加10 ml溶液Ⅰ(0.25% Triton X-100, 0.1 mol/L CaCl₂)，用组织匀浆器匀浆抽提，6 000 g离心30 min，弃上清，沉淀加10 ml溶液Ⅱ(0.1 mol/L CaCl₂,0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl) 60 ℃搅拌抽提6 min，冰浴至4℃，12,000 g离心30 min，取上清加二巯基苏糖醇至终浓度为2 mmol/L，37℃还原30 min，用20倍体积透析液透析过夜。用Forlin-酚方法测定蛋白含量，HTS为73.4 μg/g湿组织，NS为86.6 μg/g湿组织。-20℃贮存备用。

4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳:按Overall^〔4〕法制备10%分离胶，含Ⅰ型胶原(1 mg/ml)为酶底物。浓缩胶为5%，取HTS和NS MMP-1提取液各10 μl加样品处理液10 μl混匀直接点样，恒流电泳， 电泳结束后凝胶入2.5% Triton X-100漂洗30 min × 2 次。 再浸入胶原酶孵育液(0.05M Tris-HCl, 0.2 mol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂,1% Triton X-100)37℃过夜，用0.125%考马氏蓝R-250染色1 h，染色后脱色液脱色，结果背景为蓝色，有活性酶处胶原被降解，形成白色条带。

5.羟脯氨酸含量测定^〔5〕:取HTS和NS组织各2 g，剪碎后放入组织匀浆器中快速匀浆， 用醋酸调节匀浆液pH值至2.5，加入胃蛋白酶(60 mg/ml)消化72 h，加入Tris液中止反应， 装入透析袋透析过夜，获得袋内、袋外两个样品。再分别加入6N盐酸，密封后置110 ℃下水解24 h，定容后用氨基酸分析仪测定羟脯氨酸含量。袋内样本代表胶原的合成量，袋外样本代表胶原的降解量。

结果

一、原位杂交结果

MMP-1 mRNA在HTS中表达较少，阳性颗粒散在分布于真皮，阳性细胞多为成纤维细胞。NS中MMP-1表达弱而少，阳性颗粒多见于汗腺上皮，偶见有少量弱阳性颗粒分布于成纤维细胞。阴性对照切片中未见阳性颗粒。

二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳结果

MMP-1在SDS激活下能分解胶原底物，染色后在蓝色的凝胶上形成白色条带，结果显示HTS组白色条带窄而暗，酶活性低。NS组白色条带宽而亮，酶活性高， 两者差异明显。

三、羟脯氨酸含量测定结果

羟脯氨酸定量测定发现：HTS组织中羟脯氨酸含量为410.25 μg/g组织， 降解部分羟脯氨酸含量为3.6 μg/g组织，降解率仅为0.88％。NS组织中羟脯氨酸含量为293.36 μg/g组织，降解部分羟脯氨酸含量为31.39 μg/g组织，降解率为10.70％。

讨论

MMP-1是胶原降解的关键酶，在创伤修复和组织重建中具有重要作用^〔3〕。目前对HTS组织中MMP-1的研究较少。本文结果表明：MMP-1在HTS组织中表达较NS略有增加，阳性颗粒多见于成纤维细胞，但酶活性却降低，提示HTS组织中酶活性低。 有学者认为尽管HTS组织中已检测出MMP-1，但酶的活性可能受到了抑制，影响了胶原的降解^〔1〕。体内胶原的降解受许多因素的影响，如对MMP-1表达与合成的调控，酶激活剂或酶抑制剂对酶活性的影响^〔6〕。因此，以上任一环节的失调， 均可引起酶活性的改变，胶原降解的障碍。已有研究表明金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)是体内影响MMP-1活性最重要的因子，它与MMP-1形成复合体，抑制酶的活性^〔6〕。 我们业已检测出HTS组织中TIMP-1表达明显增高，提示HTS组织中MMP-1活性下降可能与TIMP-1的异常表达和对酶活性的抑制作用有关。

近年来MMP-1在创伤愈合和瘢痕中的作用已引起了人们的重视^〔6〕。有文献报道培养的瘢痕组织及成纤维细胞MMP-1活性正常或增高^〔1〕；但另一些研究发现培养的瘢痕成纤维细胞MMP-1活性降低，对新合成胶原的降解下降^〔7〕。最近Arakawa等^〔8〕报道培养HTS成纤维细胞MMP-1 mRNA表达下降。这些相互矛盾的结果可能源于研究标本的差异或采用了不同代的培养细胞，并且多为体外培养获得的结果，并不能完全反映体内酶的实际状态。目前对HTS组织中胶原酶的表达和活性是增加或减少尚无定论。由于MMP-1在正常组织中含量极低，只在创伤、 组织重塑和其它一些疾病中才有一过性的改变，而且酶的提取和活性测定很困难，故体内研究少。本实验采用一种较好的MMP-1提取方法，提取HTS组织中的MMP-1，较好地保存了酶的活性， 消除了多种因素对酶的影响^〔3〕，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶加胶原底物电泳很好地显示了酶的活性。结果表明：HTS组织中MMP-1活性明显低于NS，氨基酸分析仪测定羟脯氨酸含量也显示HTS组织中胶原的降解较NS明显减少，MMP-1活性降低、胶原降解不足可能是导致胶原异常聚积，HTS形成的一个重要原因。

参考文献

1Murray JC. Keliods and hypertrophic scar. Clin Dermatol,1994,12:27-37.

2Younai S, Nichter LS, Willisz T, et al. Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor-βin keliod and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg,1994,33:148-154.

3Agren MS, Taplin CJ, Woessner Jr JF, et al. Collagenase in wound healing: Effect of wound age and type. J Invest Dermatol,1992,99:703-714.

4Overall CM,Wrana JL,Sodek J. Independent regulation of collagenase, 72-KDa progelatinase, and metalloendopro-teinase inhibitor expression in human fibroblasts by transforming growth facotr-β. J Biol Chem,1989,264:1860-1869.

5李玉瑞. 细胞外基质的生物化学及研究方法. 北京:人民卫生出版社, 19