摘要目的用草酸－焦锑酸钾细胞化学法显示深低温（18℃）停循环（DHCA）120分钟后脑神经细胞内Ca²⁺的分布及超微结构改变。方法利用图象处理系统同时对正常组、对照组及保护组细胞内钙颗粒的体密度、数密度及颗粒大小等进行定量分析。结果DHCA120分钟后脑神经细胞超微结构破坏严重，细胞内钙颗粒明显增加。但在DHCA期间应用1,6－二磷酸果糖（FDP）脑保护液后，细胞内钙颗粒明显减少，超微结构破坏明显减轻。结论在DHCA中,

fDP可以有效地防止脑细胞的损伤。

中图号R318.03;R338.25

Quantitative Study on Ca²⁺ granules in Neuron after Deep Hypothermic Circulatory Arrest by

using Image Processing System Li Li, Shao Xinli, Liu Chunxin, et al.Center of Analysis & Measurement,

wuhan University, Wuhan 430072

AbstractObjectiveThe distribution of Ca²⁺ and ultrastructural changes in brain neuron after 120

minutes of deep hypothermic (18℃) circulatory arrest (DHCA) were determined by using K-pyroantimonate

cytochemistry method.MethodsThe image processing system was employed to measure the volume density,

count density as well as the size of the intracellular Ca²⁺ granules of the normal group, contrasting group and

the protected group.ResultsThe ultrastructure of brain neuron was damaged severely, and the intracellular

ca²⁺ granules increased significantly after 120 minutes of DHCA. When fructose-1,6-diphosphate (FDP)

cerebro-protection liquid was employed during DHCA, the number of intracellular ca²⁺ granules decreased

significantly while the damage to the ultrastructure was reduced to a great degree.ConclusionFDP can

efficiently protect brain neuron in DHCA.

Key wordscytochemistry;neurophysiology;calcium/metab;hypothermia,induced;neurons/ultrastruct;

diphosphonates/ther use;dogs

钙内流及随后的细胞内钙超载，能导致一定类型的细胞死亡，这已被认为是缺血缺氧性细胞损伤的一个基本原因。近年来临床与实验研究表明，在15℃～18℃的深低温下，脑组织可以耐受缺血缺氧的时限为45～60分钟^〔1〕，然而停循环时间太短，许多复杂畸形的修复手术又不能顺利完成。本实验采用犬DHCA模型，结合焦锑酸钾组化技术，观察DHCA120分钟后脑神经细胞内Ca²⁺分布和超微结构改变，并应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度及颗粒大小等参数进行定量分析，试图探索钙内流在超微结构改变中的重要作用，寻求一种DHCA

120分钟下脑保护的有效方法。

材 料 和 方 法

一、DHCA脑损伤动物模型的建立

用闭胸式体外循环（CPB）方法建立犬DHCA模型，动物经血流降温至鼓膜温18℃后，停止全身循环2小时.，期间以冰袋覆盖头部维持脑温，用α方式管理血气。停循环结束后复温至37℃，继续观察8小时后处死动物。

9只成年犬随机分成三组，正常组（n=1）、对照组（n=4）进行单纯18℃DHCA2小时，术中不用药物，脑保护组（n=4）于DHCA结束时经颈静脉向头部注射FDP375 mg/kg（Sigma公司产品）。其中对照组又分为DHCA结束、再灌60分钟和术后8小时三个小组。保护组分为再灌60分钟和术后8小时二个小组。取右侧额顶叶皮质观察。

二、Ca²⁺电镜组化显示技术^〔2,3〕

迅速取样后，将样品放在预冷的蜡板上并在组织表面滴预冷的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾溶液，切小组织后置于上液中进行0～4℃固定2小时，随后用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振荡浸洗，继之以1%锇酸-2%焦锑酸钾做后固定，然后进行酒精梯度脱水，环氧树脂812浸透过液，平板包埋、超薄切片后经醋酸铀与柠檬酸铅电子双重染色，日立H-600透射电镜观察、拍照。

三、对细胞内钙颗粒进行定量分析^〔4,5〕

细胞内钙颗粒的数密度（NV）为单位体积（1μm³）内该颗粒的数量，可按公式Nv=N_A·D计算^〔6〕。N_A为颗粒的面数密度，即单位截面积（A）中钙颗粒数（n），N_A＝(n)/(A)，D为颗粒的平均直径。式中n, A及同一截面内各颗粒的直径d1, d2, …, dn都可用图象分析仪测得。体密度

v_V为单位体积细胞质内的颗粒体积V_V=(n)/(i=1A_xi)/(n)/(i=1A_ri)（A_xi为第i张照片上钙颗粒的截面面积，A_ri为第i张照片上参照系的截面面积）。

二维图象上的面积通过图象处理仪很容易测得。收集资料时，在H-600透射电镜下观察，放大倍数6 000倍左右。动物共分三组：正常组、对照组和保护组。其中对照组又分为DHCA结束、再灌60分钟和术后8小时，保护组分为再灌60分钟和术后8小时.。每组约拍6张照片，共获

40张左右。电镜照片通过摄像机输入显示屏。我们通过Ca²⁺细胞化学技术能使细胞内Ca²⁺原位沉淀，在电镜下可见到高电子密度的Ca²⁺颗粒，图象处理仪很容易分辨。通过二值图分割，留下感兴趣的钙离子颗粒，由德国产IBAS图象处理系统进行分析计算，从而获得颗粒直径、颗粒平均面积、颗粒的最大径和最小径等参数。再通过计算求得数密度和体密度，结果见表1，并用t检验求出各组t值，得出各组间的参数差异程度。

结 果

一、细胞的超微结构改变

在透射电镜下可见正常组神经细胞内钙颗粒分布较少,细胞器结构正常。见图1。对照组在经DHCA 2小时后，神经细胞破坏明显，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内均可见到较多黑色圆形钙颗粒，大小不等、分布不均，呈单个沉着，见图2。DHCA2小时再灌注60分钟，致密颗粒呈簇状聚积于线粒体，粗面内质网与高尔基复合体中，细胞器破坏明显，见图3。特别是术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜模糊不清、结构消失，见图4。而脑保护组经用FDP后细胞损伤明显减轻，保护组DHCA2小时后再灌

60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒较少，见图5。保护组术后8小时细胞内钙聚积虽有所增加，但细胞器破坏不明显，见图6。

图1正常组神经细胞内黑色圆形物为钙颗粒，分布较少，细胞器结构正常×6000图2对照组DHCA2小时，线粒体肿胀，嵴断裂，胞质与线粒体内见较多高密度黑色钙颗粒，

呈单个沉着×6 000图3对照组DHCA2小时再灌注分钟，致密钙颗粒呈簇状聚集于线粒体，粗面内质网与高尔基

体中，细胞器破坏明显×10 000图4对照组术后8小时，线粒体空泡变性呈“气球样”变化，内有簇状钙沉着，部分线粒体膜

模糊不清，结构消失×10 000图5保护组DHCA2小时再灌注60分钟，细胞形态基本完整，线粒体轻度肿胀，细胞内钙颗粒有

所减少×6 000图6保护组术后8小时，细胞内钙聚集虽有所增加，但细胞破坏不太明显×6000

二、细胞内钙颗粒的定量分析结果

应用图象处理系统对细胞内钙颗粒的数密度、体密度、颗粒平均面积及最大径和最小径进行测量，测量结果见附表,图7。统计结果表明，对照组中DHCA结束，再灌60分钟与术后

8小时细胞内钙颗粒的数密度、体密度与正常组比较有高度显著性差异（P＜0.01），而保护组中再灌60分钟和术后8小时组与对照组相比也有高度显著性差异（P＜0.01）。说明脑保护液能有效地阻止DHCA2小时后细胞内Ca²⁺聚积并维持了细胞结构的基本正常。

讨 论