电击法可将外源基因转移进入多种细胞。但有关其介导外源基因进入脐血细胞的研究尚未见报道,为此,本文在此方面作了一些探讨,现作一报道。

一、材料与方法

1.材料 ①质粒:pKoneo为新霉素抵抗基因的真核表达载体,由Dr.Donald Hanahan(美国)提供。

pBlac Z为β-半乳糖苷酶基因的真核表达载体,本校生化室屈伸教授提供。②电脉冲仪:Bio-Rad公司生产。电脉冲杯0.4cm,为仪器配套产品。③脐血:取自健康、自然分娩产妇。④试剂:RPMI

1640、小牛血清、无血清培养基、G418、X-gal均为Gibco bRL产品。

2.方法 ①脐血单个核细胞的制备与培养:按常规方法进行。②质粒的扩增、纯化:均按常规方法操作。③电击条件:参照仪器厂家推荐条件及文献方法进行^〔1〕。电击介质:0.01 mol/LPBS,

pH7.2。细胞数:2×10⁶。质粒:设2个组A单基因组;B共转移组。A组加pBlac z 20 μg,B组在前者基础上再加入pKoneo 1 μg。室温,电容:22 μF。场强:1500 V/cm。放电时间:1秒。电击次数:连续电击3次,间隔数秒。④细胞存活率:以苔盼蓝拒染率计。⑤X-gal染色:本室方法^〔2〕。

⑥G418筛选:转导细胞经复苏后加入终浓度为1 mg/ml的G418进行选择。转导阳性可在该体系中存活,而非转导细胞则很快死亡。

二、结果

1.基因转移的效率及细胞存活率

经上述条件介导,单基因组及共转移组在细胞存活率为50.83±4.07%及50.17±5.04%的情况下分别可获得8.83±3.31%及8.33±2.50%的基因转移率。两组之间基因转移率无显著性差异(P＞0.05)。

2.转导阳性细胞的富集

共转导基因组转导阳性细胞可抵抗G418的毒性作用,于含有G418的体系中存活。而未转导细胞则很快死亡。从而使得转导细胞得到选择、富集。富集后X-gal染色阳性细胞率达到38.33±4.55%。

比富集前及单基因转移组阳性率明显升高(P＜0.01)。

三、讨论

基因转移是基因治疗的前提。Neo^R以及Lac z基因是两个常用的标志基因之一,已被广泛使用^〔2〕。Neo^R基因产物可使受体细胞抵抗G418的毒性而用作选择标志。Lac z基因产物可使受体细胞被X-gal染成蓝色而用作识别标志。本实验采用以上基因对脐血细胞进行了电击法介导的基因转移探讨。结果显示:应用Bio-Rad公司产品电脉冲仪,结合厂家推荐条件及文献资料,在维持良好的细胞存活率的情况下可获得较高的基因转移率。尤其采用共转导方式。经选择、富集后,转导阳性细胞率可达38.33±4.55%较单基因转导组及选择前显著增高(P＜0.01)。

这一结论对于进一步探讨以脐血细胞作为受体细胞进行基因治疗以及基因标志研究有一定的参考价值。

参 考 文 献

1 Toneguzzo f,Keating A.Stable expression of selectable genes introduced into human hematopoietic stem

cells by electric field-mediated DNA transfer.Proc Natl Acad sci,1986,83:3496-3510.

2 陆华中,邹萍,李崇渔.造血干细胞基因转移及其表达的实验研究.实验血液学杂志,

1997,5:239-241.(收稿 1997-07-02 修回 1997-12-14)