关键词： 白细胞；慢性脑灌注不足；脑损害

摘要：目的探讨白细胞的活动在慢性脑灌注不足脑损 害中的作用。方法40只老龄大鼠持久性双侧颈总动脉结扎 （2VO），免疫组化法单抗OX1抗白细胞共同抗原标记白细胞， 实验研究为持久性2VO1～4月。结果持久性2VO后皮层、海马 和白质处均有显著的白细胞活动。1～4月，皮层、海马和白质 处白细胞的活动均明显减少，而脑损害却加重。结论白细胞 的活动涉及大鼠慢性脑灌注不足脑损害的病理过程，但白细 胞的活动在大鼠慢性脑灌注不足脑损害，特别是大脑白质损害 中仅起次要作用。

中图分类号：R743文献标识码：A

文章编号：100 7－5496(2000)10－1496－02

Activation ofleukocytes in brains after chronic cerebral hypoperfusion in aged rats

LIU Zhi rongLI Lu shiFAN Wen hui

（Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China）

Abstract:Objective To investigate the effects of activation of leukocytes on brain damages after chronic cerebralhypoperfusion. Methods Both common carotid arteries were ligated bilaterally in 40 Wistar rats. Leukocytes were observedwith immunohistochemistry for leukocyte common antigens. Activation of leukocytes and brain damages were theninvestigated from 1 to 4 months after the ligation. Results There was an extensive activation of leukocytes in cortex,hippocampus and white matter after chronic cerebral hypoperfusion. From 1 to 4 months, activation of leukocytes wasreduced in cortex ,hippocampus and white matter. Meanwhile, brain damage became heavier from 1 to 4 months. ConclusionActivation of leukocytes is involved in chronic pathological condition of brain after chronic cerebral hypoperfusion. Activationof leukocytes may play little role in the pathogenesis of brain damages, especially in white matter after chronic cerebralhypoperfusion.

Key words:leukocytes;chronic cerebral hypoperfusion;brain damage

随着缺血性脑损害机制研究的不断深入，免疫炎症 反应在缺血性脑损害中的作用渐为人们所关注。研究发现脑缺 血的病理过程有免疫应答的参与，脑缺血损伤级联反应产生 的氧自由基、酶和细胞因子等可诱导白细胞和内皮细胞上粘附 分子的表达，激活白细胞入侵脑实质。白细胞可通过阻塞毛 细血管和释放血管收缩物质减少损伤区血流灌注，同时分泌细 胞毒性物质如蛋白酶、氧自由基、脂质类介质等损伤脑组织^［1,2］，目前的研究认为入侵的白细胞对缺血脑组织造成第二次 脑损害。但这方面的研究多集中在急性脑缺血损伤效应上，对 可导致多发性脑梗死和老年性痴呆的慢性脑灌注不足的研究 鲜有报道。

本实验通过老龄大鼠持久性双侧颈总动脉结扎(2VO)之慢 性脑灌注不足模型，探讨白细胞的活动对慢性脑灌注不足脑损 害的影响和可能机制。

1材料与方法

1.1动物模型与分组40只老龄（月龄≥12个月）Wistar大鼠 ，雌雄不限，体重300～450g,随机分成对照组、持久性2VO1、 2、3和4月组，每组4～10只大鼠。参照Wakita等^［3］制作慢性脑 灌注不足动物模型。大鼠术前12h禁食，4h禁水。用20％乌 拉坦按800～1000mg/kg体重腹腔注射麻醉，保证手术操作期间有 自主呼吸。颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结 扎，术中大鼠肛温保持在36.5～37.5℃，手术后动物送至有通风 和空调设备的动物房饲养，每天供足食、水。对照组动物仅行 颈前切开,不结扎颈总动脉。

1.2标本制作与组织学检查取持久性2VO1、2、3、4月组和 对照组大鼠各3只，20％乌拉坦腹腔深麻醉，生理盐水250ml经 左心室灌注去除血管内血细胞，4℃4％多聚甲醛200ml灌注固定 后分离出大脑，正中冠状切开，置入4％多聚甲醛（4℃）中放 置10～12h，再入10％糖溶液浸泡至沉底后，－20℃连续冰冻 冠状切片，片厚约20μm。切片放入0.01molPBS液中4℃保存备用 。组织学检查取对照组、持久性2VO2月和4月组各3只，同样步 骤至4％多聚甲醛后固定48～72h后行石蜡包埋，石蜡切片，片 厚约5μm，经贴片、脱蜡处理、HE染色、封片存放，光镜观察 。

1.3免疫组化实验冰冻切片入3％H2O2浸泡15min去除内源性 过氧化物酶活性,0.01molPBS液漂洗5min,2次，入10％正常山羊血 清封闭室温孵育10min。切片与抗白细胞共同抗原之单抗OX1(1:5 0),37℃孵育1h并4℃过夜，0.01molPBS液漂洗5min,3次，入生物素 标记的二抗（普通型SP试剂盒，1:100)37℃孵育30min，0.01molPB S液漂洗5min,3次。再与辣根过氧化物酶标记的卵白素三抗（普 通型SP试剂盒，1:100）37℃孵育30min，切片继续0.01molPBS液漂洗 5min,3次。最后经DAB试剂显色，表片、风干、脱水及透明后封 片存用。

2结果

2.1实验动物死亡率40只老龄大鼠用于实验，持久性2VO后 死亡15只，死亡率37.5％。

2.2白细胞免疫组化实验分析对照组未发现OX1单抗标记 的白细胞。缺血1月后皮层、海马和白质处均见入侵的白细胞 活动，以皮层及皮层下为主，在梗死区和血管周集聚。缺血1 ～4月，皮层、海马和白质处白细胞的活动明显减少。

2.3组织学分析对照组未发现明显的病理变化。缺血2月 后皮层下、内囊及海马区白质出现较大的软化灶，伴有胶质细 胞和小血管增生。灰质内见单个或多个神经元缺血性改变， 胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕（图1）。缺血4月 后，皮层和海马处神经元固缩退变更为明显。同时，出现胶质 增生小结，并出现噬神经细胞现象（图2）。

图1缺血2月后皮质内神经元变化

图2缺血4月后皮质内神经元变化

3讨论

目前研究表明，脑缺血12h，白细胞开始入侵脑实质， 1～3d达高峰，7d后渐消失^［4］。本实验发现，慢性脑灌注不足1～ 4月白细胞分布于整个皮层、白质和海马，由此看出慢性脑灌 注不足是一个渐进损伤的过程，白细胞的活动贯穿于整个病理 过程中。同时实验发现，慢性脑灌注不足后白细胞在缺血损 伤区的血管周围和梗死半暗区高度聚集，在未见梗死的缺血区 域散在出现，说明白细胞入侵的程度与慢性脑灌注不足脑损 害的程度相一致。文献报道^［5］，大量白细胞在缺血区的入侵， 可增强缺血后神经元损伤，其作用的机制主要是:(1)白细胞的 聚集，减少了血管内的血流量，并可诱发血栓形成；(2)白细胞 活化后产生大量神经毒性物质，如氧自由基、含颗粒的酶、 蛋白酶衍生物、毒性细胞因子IL－1和TNF等损伤神经元；(3)通过 损伤所粘附的血管内皮细胞，增加血脑屏障的通透性,引起水 肿、缺血和炎症反应之间的多次循环。脑缺血后白细胞入侵 缺血区通过两条途径完成，一是通过溃变的血脑屏障^［4,5］，另 一是通过与内皮细胞粘附转进^［6］。慢性脑灌注不足脑损害是一 个渐进的过程，整个血脑屏障相对完好，作者认为广泛区域 的白细胞入侵是靠与内皮细胞的粘附转进的，而梗死区白细胞 的入侵则是两种途径均存在。在白细胞的粘附转进中，缺血 区变性坏死的神经元、轴突产生的白细胞趋化因子起始动作用 ，白细胞上表达的粘附分子CD11q/CD18或CD11b/CD18起关键作用，它 们能与内皮细胞上的受体ICAM－1发生高特异性受体配体交叉 反应，从而使白细胞透过血脑屏障，入侵脑实质。文献报道^{［6 ～8］},脑缺血后阻塞细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子可明显 减轻缺血区白细胞的浸润及脑损伤；另外，缺乏ICAM－1和MaC－ 1（CD11b/CD18）的大鼠，脑缺血后白细胞的浸润显著减少，脑损 伤明显减轻。说明白细胞趋化因子、ICAM－1和MaC－1在脑缺血 白细胞粘附转进中具有重要作用。本实验的另一个发现就是从 1月到4月白细胞虽贯穿于整个过程，但入侵的数量却逐渐下降 ，尤以白质为明显。可能的解释是慢性脑灌注不足脑损害与 修复反应并行，随着时间的演进，缺血区广泛区域内微环境的 稳态得以重建，从而使得缺血区内趋化因子产生减少，内皮 细胞上ICAM－1分子以及白细胞上CD11/CD18分子的表达下调，白细 胞浸润因而减少。这些实验结果提示慢性脑灌注不足的病理 过程有白细胞的参与，但白细胞的活动在慢性脑灌注不足脑缺 血损害，尤其是白质损害中仅起次要作用。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770273)

作者简介：刘之荣(1966－)，男，云南人，神经内科主治医师 ，硕士，研究方向：脑血管病的临床和基础。

参 考 文 献 :

［1］Garcia JH, Lju KF,Yos