关键词： 脑缺血；环氧酶－2；细胞凋亡

摘要：目的探讨环氧酶－2蛋白与细胞DNA损伤的关系 。方法采用大鼠大脑中动脉阻塞脑缺血模型，应用HE染色观 察缺血损伤的演变，免疫组化染色观察环氧酶－2蛋白的表达 ，DNA末端标记法(TUNEL)法观察细胞DNA损伤。结果环氧酶－2蛋 白的表达与TUNEL阳性细胞在时程上一致，解剖部位上重叠。结 论环氧酶－2是诱导细胞凋亡的重要因素，脑缺血后环氧酶 －2的高度表达促进了梗死范围的扩大。

中图分类号：R743.3文献标识码：A

文章编号：1 007－5496(2000)10－1494－02

nduction ofcyclooxygenase－ 2 (COX－ 2) contributes to neuronal apoptosis in focal cerebral ischemia in rats

ZHANG Zai qiangLONG Jie LI Xiao linget al

（Beijing Tiantan Hospital , Capital University of Medical Science,Beijing 100050,China）

Abstract:Objective To investigate the relationship between COX－ 2 and DNA damage. Method A model of middle cerebralartery occlusion in rats was performed with the intraluminal filament occlusion. The progression of ischemic injury wasobserved by hematoxylin and eosin stain, the expression of COX－ 2 protein was determined by immunohistochemistrystaining, and TUNEL staining was employed to detect the DNA damage. Results COX－ 2 protein induction paralleledtemporally and overlapped anatomically the appearance of TUNEL－ positive cells in ischemic penumbra. ConclusionCOX－ 2 is an important candidate for neuron killers, and overexpression of COX－ 2 after cerebral ischemia maycontribute to the delayed progression of the injury occurring at the periphery of the infarct.

Key words: cerebral ischemia; cyclooxygenase－ 2(cox－ 2); apoptosis

环氧酶（COX）是花生四烯酸代谢的关键性限速酶，存在 2种异构体：COX－1在多类细胞中呈结构性表达，产生前列腺素 ，完成正常生理功能；COX－2由内毒素、细胞因子等诱导表达 ，其反应产物可产生细胞毒性损害。脑缺血后COX－2的表达具 有时空变化规律^［1］，文献报道^［2］应用高度选择性的COX－2

拮抗剂可减轻缺血性脑损害，提示脑缺血后COX－2的表达可 能导致损伤范围的扩大。为此，本研究观察了缺血脑组织连续 切片COX－2免疫组化与TUNEL染色，探讨COX－2与DNA损伤的关系。

1资料与方法

1.1实验动物Wistar雄性大鼠55只，体重250～300g，月龄2.5 ～3.0个月，由中国医学科学院动物研究所提供。随机将大鼠分 为正常对照组、脑缺血1、4、12、24及48h组，缺血组各配1个假 手术组，每组5只。

1.2大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型参照Longa等^［3］ 线栓法，略有改进，栓线采用直径0.22mm尼龙鱼线，头端5mm膨大 (直径约0.25－0.28mm),栓线从颈外动脉与颈总动脉分叉处进线约 20mm遇阻即止，全部大鼠均栓塞右侧大脑中动脉。假手术组栓 线进入15mm。模型成功的标志为：麻醉清醒后，大鼠左侧偏瘫 ，左下肢伸直，站立不稳，向一侧转圈。

1.3标本制备大鼠于相应的时间点取材，4％多聚甲醛经 心脏灌注固定，脑组织固定后12h，石蜡包埋，连续切片，切 片5μm厚。相邻大脑切片分别用于HE染色、COX－2免疫组化染色 及TUNEL染色。

1.4COX－2免疫组化染色采用免疫组化ABC染色法。一抗COX－2抗体(山羊抗鼠IgG,Santa Cruz公司)，稀释度为1:100，二抗生物 素化兔抗山羊IgG（Santa Cruz公司），稀释度为1：100，二氨基联 苯胺显色系统显色，苏木素复染。应用MPIAS－500多媒体彩色病 理图文分析系统对阳性细胞进行计数。

1.5DNA末端标记法（TUNEL）操作程序按照原位细胞凋亡检 测试剂盒（德国Boehringer Mammheim公司）说明书进行，阳性对照 采用加TUNEL反应液前用核酸酶（10μg/ml）室温下10min诱导DNA片 段，阴性对照采用所加TUNEL反应液中不含末端转移酶。

1.6统计方法应用Systat统计软件包的方差分析对数据进行 处理。

2结果

2.1COX－2免疫组化结果正常对照组、假手术组、左侧大 脑组织、缺血1h和4h组均未见阳性着色细胞，缺血12h开始出现 棕黄着色细胞，为(46±19)个/mm²;24h达到高峰(70±14)个/mm²，48h 又出现下降趋势为(41±13)个/mm²(方差分析P＜0.01)。阳性细胞大 部分位于梗死边缘带，其内带（近梗死中心）阳性细胞胞浆皱 缩、胞核浓缩，呈角形；其外带（背离梗死中心）细胞形态 完整。阳性着色细胞见于神经元和血管内皮细胞，胶质细胞都 无着色。

2.2DNA末端标记法染色结果正常对照组无阳性细胞出现, 各个假手术组可见0～3个阳性染色细胞。缺血1h阳性着色细胞 即开始增多，随着缺血时间延长，缺血24～48h阳性细胞数量达 到高峰。阳性细胞主要位于梗死边缘区，其内带的细胞核皱 缩、深染，部分可见凋亡小体，胞浆模糊。外带细胞核形态基 本正常、部分核浅染。阳性细胞统计主要包括核形态皱缩、 深染细胞；而核呈园形、浅染或肿胀细胞不计在内。不同缺血 时程凋亡细胞数量分别为：1h计数为(9±3)个/mm²,4h计数为(16± 3)个/mm²,12h计数为(23±5)个/mm²,24h计数为(69±6)个/mm²,48h计数 为(46±4)个/mm²,方差分析P＜0.01。

3讨论

脑缺血后不同脑区的神经元死亡过程不同步，缺血中心 区神经细胞由于严重缺血而迅速发生坏死；缺血周边区（半暗带）组织损伤演变过程相对缓慢，可持续数小时，大部分神经元选择细胞凋亡方式而死亡。目前涉及缺血半暗带神经细 胞继发性损伤的因素尚未完全明了，尽管有证据表明炎症促进了脑缺血后组织损伤的发展，但其作用机制仍不十分清楚。 近年研究发现前列腺素合成酶COX－2是炎症过程中细胞毒性损 伤的重要因子，为此本实验对脑缺血后COX－2的表达与DNA损伤 之间的时空关系进行了观察。实验发现缺血半暗带神经元COX－ 2表达上调，半暗带外带的一些COX－2阳性细胞缺乏缺血性病理 改变的特征；而在梗死与正常脑组织间的移行区，COX－2阳性 细胞具有缺血性改变的特征（HE表现为“红色神经元”）。TUN EL阳性细胞主要集中在半暗带的内带，神经元具有凋亡细胞的 形态学特征；半暗带的外带也拥有较多的TUNEL阳性染色细胞， 但核形态相对完整，说明其存在DNA损伤，而细胞可能存活。连 续切片比较发现，COX－2与TUNEL阳性细胞在解剖部位上具有相 当的一致性。

对COX－2与TUNEL阳性细胞出现时程的比较发现，早在缺血 后1h即有TUNEL阳性细胞，而COX－2蛋白于缺血12h左右才开始表达 ，但二者的高峰都出现在24～48h左右。提示COX－2并未参与超 急性期神经细胞DNA的损伤过程，而是在相对延迟期导致DNA损伤 ，加速半暗带组织损害，促进梗死范围的进一步扩大。

COX－2阳性细胞与TUNEL阳性细胞在时程上一致，在解剖部 位上重叠，说明COX－2是神经元凋亡的重要候选因素。近年研 究认为c－Jun磷酸化是氧化应激诱导神经元凋亡过程的重要步 骤，Matsuoka等^［4］观察到短暂前脑缺血脑组织CA1区84％的锥体神 经元表达COX－2，并且与c－Jun磷酸化部位重叠，认为COX－2是神 经元凋亡的重要因素。COX－2可能通过多种途径损伤神经细胞 的DNA结构，从而诱导细胞凋亡。首先，脑缺血后花生四烯酸代 谢的环氧酶途径可产生大量的活性氧自由基（ROS），ROS可直 接破坏DNA结构，引起细胞死亡；另外该途径所产生的前列腺素 类物质属于促炎症因子，可诱导产生一系列的细胞因子，发 挥细胞毒性作用。

在半暗带的外带甚至远离区（大脑前动脉区），COX－2 阳性细胞中部分TUNEL阳性，部分呈阴性反应，但细胞形态均完 整，其意义尚不确定。Tomimoto等^［5］发现在脑缺血的慢性阶段（ 28d～11年），COX－2主要由小胶质细胞表达，神经元仅有稀少的 表达。该学者认为在脑缺血恢复阶段，COX－2反应产物参与突 触的重塑，可能有益于脑组织的修复及脑功能恢复。Sairanen等 认为在缺血急性期，COX－2通过前列腺素类活物和自由基引起 组织损伤；而在延迟期梗死的远离区胶质细胞和神经元表达CO X－2可能助于组织修复及神经网络的重建。

基金项目：北京市自然科学基金资助(7982022)

作者简介：张在强(1965－)，男，神经内科主治医师，硕士学 位，研究方向：脑血管病神经病理学。

参考文献：

［1］张在强，龙洁，路敦跃.大鼠局灶性脑缺血后脑组织环氧 酶－2蛋白的表达［J］.中华神经科杂志，2000，33(1)：42－44

［2］Nogawa S,Zhang F,Ross ME,et al.Cyclooxygenase－ 2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage<