关键词： DNA裂解率；脑缺血再灌注；细胞凋亡；金纳多

摘要：目的探讨大鼠脑缺血再灌注损伤中大脑皮质DN A裂解率的变化及金纳多的保护作用。方法采用四血管闭塞 法制备大鼠脑缺血再灌注模型后，用二苯胺法测定脑缺血再灌 注组及金纳多治疗组随缺血再灌注时间延长皮质DNA裂解率变 化。结果脑缺血后DNA裂解率增加，单纯缺血组与假手术组相比P＜0.01; 再灌注后DNA裂解率随时间延长进一步增加，再灌注24h达高峰， 与3h相比P＜0.01;金纳多治疗组与盐水对照组相同时间点DNA裂解 率相比明显减少(P＜0.01)。结论脑缺血后有DNA断裂损伤，并随 再灌注时间延长进一步增加，金纳多能降低DNA裂解率，保护 神经元。

中图分类号：R743文献标识码：A

文章编号：100 7－5496(2000)10－1505－02

Study on the changeof DNA Splitting rate

and the protective effect of Ginaton

of ischemia and reperfusion in rats

HAN Xue－ mei,YANG

Hong,WANG Chun－ hui.Third Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130031,China

Abstract:Objective To observe the DNA splitting rate of cerebral cortex and Ginaton's protective effect on it .Methods The rats cerebral ischemia and reperfusion model by four－ vessel occlusion method was used to observe the change of DNA

splitting rate between ischemia and reperfusion group and Ginaton group.Result The DNA splitting rate increased after ischemia and more obviously increased with reperfusion time longhthing and peaked at 24h after reperfusion (P ＞0.01,

compared with 3h).The DNA splitting rate obviously decreased in Ginaton group at the accordingly time.Conclusion There is DNA breaking injury after ischemia and it is increased with lenghthly of reperfusion time .Ginaton can decrease DNA breaking injury,so it has protective effect to the injury of ischemia and reperfusion.

Key words： DNA splitting rate; ischemia and reperfusion;apoptosis;Ginaton

脑缺血再灌注后细胞凋亡的研究受到极大重视。自从细 胞凋亡的概念被提出以来，它使人们认识了一种与坏死不同 的细胞死亡形式，并在生理、病理学上发挥着极其重要的作用 。细胞凋亡最主要的生化改变是DNA断裂成不同倍数的180～200 个碱基对片断^[1]。根据报道银杏叶制剂有脑保护作用，金纳多 是第四代银杏叶制剂，其主要成分为银杏黄酮甙和银杏内酯 ，其是否有抗凋亡作用国内外尚未见报道。本文报告脑缺血再 灌注损伤后皮质DNA裂解率变化及金纳多对其保护作用。

1资料与方法

1.1动物模型制备及分组健康雄性Wistar大鼠，体重(220±5 0)g，由白求恩医科大学动物部提供。动物模型采用Pulsinelli四 血管闭塞法[1]进行制备。动物分组：将Wistar大鼠40只分成8组， 每组5只。Ⅰ组：假手术对照组，Ⅱ组：单纯缺血30min组，Ⅲ_a 组：再灌注3h组，Ⅲ_b组：再灌注6h组,Ⅲ_c组：再灌注24h组，VI_a 组：金纳多(7.29mg/kg)腹腔注射后－缺血30min－再灌注3h组，VI_b组 ：再灌注6h组，VI_c组：再灌注24h组。金纳多为德国威玛制药厂 生产。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均按金纳多相同体积腹腔内注射生理盐 水做为金纳多对照组。

1.2二苯胺法测定DNA裂解率动物于脑缺血再灌注不同时间 点断头处死，取皮层100mg加0.9ml裂解液制成10％匀浆，反复冻 融后13000r/min离心15min，分别收集上清和沉淀，沉淀溶于1.5ml TE(10mMTris,lmMEDTA,pH8.0)中，上清和沉淀中分别加入1.5ml10％TCA过 夜，13000r/min离心15min,取沉淀加入0.6ml15％TCA,100℃水浴15min, 冷却后400r/min离心15min，收集上清加入二倍体积二苯胺溶液，3 0℃反应1618h，于600nm处用分光光度计测定其吸收值。DNA裂解 率=上清吸收值/(上清吸收值＋沉淀吸收值)。

2结果

大脑皮质DNA裂解率I组：0.410±0.054，Ⅱ组：0.571±0.041， Ⅲa组：0.576±0.033，Ⅲb组：0.667±0.043，Ⅲc组：0.678±0.051。

脑缺血后DNA裂解率增加，单纯缺血组与假手术组相比P＜ 0.01,再灌注后DNA裂解率随时间延长进一步增加，再灌注3h组与 单纯缺血组相比P＜0.01，6h组与3h组相比P＜0.01再灌注24hDNA裂解 率最高，与3h相比P＜0.01。

金纳多治疗组DNA裂解率分别为Ⅵa组0.496±0.033，Ⅵb组0. 547±0.024，Ⅵc组0.557±0.035，与盐水对照组相同时间点的DNA裂 解率相比，金纳多治疗组DNA裂解率减少，差异显著(P＜0.01)。

3讨论

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，即在各种信号刺激下细 胞自身代谢机制被激活，主要为内源性核酸内切酶被激活， 并在严格基因控制下需要特定蛋白质合成和能量的主动连续过 程，以往一直认为坏死是脑缺血后神经元死亡的惟一方式， 但最近许多学者利用在体脑缺血动物模型进行了大量研究，从 形态、生化、基因等多种角度证明细胞程序性死亡(PCD)存在于 脑缺血再灌注损伤中^[23]，特别在迟发性神经元死亡中起十 分重要作用。在短暂性脑缺血模型中，沙土鼠脑缺血10min后再 灌注12h即出现DNA片段，并于48h达到高峰^[3]。在短暂脑缺血中细 胞凋亡是一动态发展过程，主要分布于选择易感区与半暗区 ，并随缺血时间的延长提前出现，同时扩展其范围。由于DNA断 裂是细胞凋亡的重要特征，因此本实验用二苯胺法定量测定D NA裂解率，发现单纯脑缺血后DNA裂解率与对照组相比明显增加 (P＜0.01),并随再灌注时间的延长逐渐增加。充分证明细胞凋亡 在全脑缺血再灌注损伤中是一早期发生的动态持续过程，且系 细胞死亡的重要形式。有实验证明将自由基生成剂注入侧脑 室20min后即有凋亡特征的DNA片断出现^[4]。因此认为DNA损伤是细 胞凋亡的一个主要特征。银杏叶制剂金纳多是目前广泛应用于临床治疗缺血性脑卒中的确良药物之一，其可能通过增加和抑制相关基因的表达而起到抗凋亡的作用。本结果表明金纳多可明显减轻及缺血再灌注损伤并降低DNA裂解率，说明其能够减轻脑缺血再灌注后神经元损伤及减少缺血性凋亡，具有脑保护作用。

作者简介：韩雪梅(1972－)，女，吉林人，神经内科主治医师，硕士，研究方向：脑血管病。

收稿日期：2000－07－14