摘要：目的探索兴奋剂促红细胞生成素(EPO)的检测方法。方法制备了抗重组EPO(rHuEPO)的两株单克隆抗体：McAbF8和McAbF11,同时纯化了天然螺旋藻中的藻胆蛋白。以McAbF8作包被抗体，建立了检测血清中EPO浓度的竞争ELISA法；并将藻胆蛋白作为荧光探针标记McAbF8，建立了检测血清中EPO浓度的荧光免疫检测法，其检测线性范围为10－10～10－12mol/L。结果用于同样样本的血清检测，与竞争酶联免疫吸附法所测结果无显著性差异(P＞0.05)。结论荧光免疫检测法在灵敏度和特异性等方面，并不亚于传统的酶联免疫吸附法(ELISA)，而在有些方面还要优于ELISA，它在检测中将获得更大的应用。

中图分类号：R446.6文献标识码：A

文章编号：1007－5496(2000)09－1362－03

A Monoclonal Antibody－based Immuoassay for Doping of Erythropoietin in Sports

TONG Wei－qun,WANG Yuan－xun,CHEN Suo,et al

（Beijing Teachers College of Physical Education,Beijing 100088,china）

Abstract：Objective To find the detecting method of erythropoietin(EPO).Methods A kind of doping,two hybridoma cell lines,McAbF8 and McAbF11,were set up and phycobiliprotein was purified using McAbF8 as the coating antibody,the method of the competitive ELISA to detect EPO in serum was set up.At the same time,McAbF8 was labeled with phycobiliprotein and a new type of fluroscent probe was developed.The linear scope ranges from 10－ 12 to 10－ 10 mmol/L.Results The probe was used in detecting EPO concentration in the same samples. No significant difference was found between the two methods.(P ＞0.05).Conclusion The imunofluorescent assays is not inferior to the traditional enzyem－ linked immunoadsorbent assay(ELISA)in some respects,it has even advantages over ELISA.So the method may be put into more utilization in the detection.

Key words:erythropoietin(EPO);Doping;monoclonal antibody;phycobiliprotein;fluorescent probe

本研究成功地制备了两株抗重组EPO(rHuEPO)的单克隆抗体，建立了检测血清中EPO含量的竞争酶联免疫吸附方法；同时，把从钝顶螺旋藻中提取纯化的藻胆蛋白作为荧光标记物，标记单克隆抗体，建立了检测血清中EPO含量的荧光免疫法。经与酶联免疫吸附方法(ELISA)比较，无显著差异。本研究首次用荧光探针藻胆蛋白(PBP)标记检测EPO，建立了可用于体育药检的特异的检测方法。这对兴奋剂EPO的检测具有重要的意义。

1资料与方法

1.1材料rHuEPO(中日友好医院惠赠)，抗rHuEPO杂交瘤细胞株、钝顶螺旋藻由北京大学生命中心单克隆抗体实验室提供，BALB/c小鼠、昆明小鼠购自流行病研究所。DEAE－SepharoseFastFlow、Phenyl－sepharoseCL－4B,ProteinASuperoseFastFlow、sephacrylS－200HR、SephacrylS－300HR均为Pharmacia产品。其余试剂为Sigma产品或国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1抗人促红细胞生成素单克隆抗体的制备复苏抗rHuFPO杂交瘤细胞，采用动物体内诱生单克隆抗体的方法^[1,2]，大量制备腹水。用快速蛋白液相分析仪(FPLC)，联合使用疏水柱(Phenyl－SepharoseCL－4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱纯化单克隆抗体。

1.2.2单克隆抗体理化性质及亲和力的鉴定采用双向免疫扩散法、紫外分光光度计法和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别测定单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚类、浓度和分子量。参照Beatty等人^[3]所建立的方法，寻求抗体与固定化抗原亲和常数。确定抗体的工作浓度，并以此浓度，按照Friguet^[4]的方法选择最合适的抗原包被量。作OD450nm与对数抗原稀释度的关系曲线，求得液相亲和常数^[5]。

1.2.3藻胆蛋白的制备、纯化及性质测定培养钝顶螺旋藻，收集的鲜藻泥通过硫酸铵分级分离法得到藻胆蛋白的粗品。联合使用DEAE－SepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS－200HR柱进一步纯化藻胆蛋白，得到的纯品进行分子量测定，并测定藻胆蛋白的激发和发射光谱。

1.2.4单克隆抗体—藻胆蛋白荧光探针的制备5mgPBP和5μgSPDP依洪孝庄[6]等人的方法进行偶联，制备单抗—藻胆蛋白的偶联物。

1.2.5竞争酶联免疫吸附试验检测方法检测血清EPO的含量以测定抗体与溶液中抗原的亲和常数时所用抗体浓度作为抗体的工作浓度，并以其所用抗原包被量包被酶标板。将含一定量rHuEPO的标准溶液按倍比稀释与定量McAb溶液分别混合，室温下温育15min后加入以rHuEPO包被的酶标板中，以EPO稀释倍数的对数(以2为底)为横坐标，OD450nm为纵坐标绘制标准曲线。将正常人血清100μ1与建立标准曲线时同样量McAb混合，室温下温育15min后加入与建立标准曲线时同样量rHuEPO包被的酶标板中，同上操作，所测数据即为血清中EPO含量的OD值，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。

1.2.6荧光免疫法检测血清中EPO的含量用McAb包被酶标板，4℃冰箱过夜后0.01MPBS－T洗3次，每孔加入对应浓度为10－12～10－10mol/L之间的一系列标准EPO溶液，与过量IgG－PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)37℃下保温1h，酶标板用PBS－T洗涤(3×3min)，加入荧光洗脱液100μ1/孔，50℃下温育30min。同一样品做5孔。收集相同5孔内的液体，HITACHIF－4500荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度，画出标准曲线。用McAb包被，4℃冰箱过夜后0.01MPBS－T洗3次，每孔加入50μl正常人血清样品与过量IgG－PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)，以下操作同上，荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度后，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。

2结果

2.1单克隆抗体的性质我们得到了稳定分泌抗rHuEPO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为McAbF8,McAbF11。经琼脂双向免疫扩散法鉴定，McAbF8的亚类为IgG1，McAbF11的亚类为IgG2b，

分子量均为147kD。McAbF8与固定化rHuEPO的亲和常数为2.3×106M－1。

按照1.2.2所述方法，测得在抗原包被量为每孔0.02μg时，OD450nm与一抗浓度成正比，且酶标板上抗原对抗体的吸附量小于10％。图1为在此条件下OD450nmMcAbF8浓度的关系图。图2为测定McAbF8和溶液亲和常数的曲线，确定该亲和常数为2.0×107M－1。其中横坐标log2{[Ag]/[Ag0]}为抗原稀释的对数。rHuEPO稀释前的浓度[Ag0]和McAbF8的工作浓度分别为1.28×10－10M和1.0×10－10M.2.2藻胆蛋白的制备、纯化及性质测定钝顶螺旋藻藻种的不同使提取出的各种PBP的含量也有所差异。本实验所用螺旋藻中主要纯化的是APC(图3，4)。图3中平衡缓冲液为0.02mol/L,Tris－HCI(pH7.8)，洗脱终盐浓度为0.5mol/LNaCl，0.25mol/LNaCl浓度时洗下的峰d为APC。图4中洗脱缓冲液为含150mmol/LNaCl的0.02mol/LTris－HC1(pH7.8)，流速2ml/min，峰b为APC。

测得APC两个亚基具有相同的分子量，均为23.5kD。APC分子量为47kD。APC的激发和发射光谱采用HITACHI－F4500荧光分光光度计进行测定，确定最佳激发波长为575nm，最佳发射波长为662nm。

2.3单克隆抗体—藻胆蛋白荧光探针的制备依1.2.4所述方法制得McAb－APC偶联物，见图5。其中洗脱缓冲液为0.1mol/L的PBS(pH7.5)，流速0.25ml/min。峰a为Ig－APC偶合物，峰b为未标记的McAb和APC。实线区表示此部分偶合物为以后实验所用。

2.4竞争ELISA法检测血清EPO含量标准曲线的制定测得在抗原包被量为每孔EPO0.2μg，McAbF8含量为1.0×10－10M时，OD450nm与一抗浓度成正比。由于所选用的抗体工作浓度在图1所示的线性范围内，所以当加入竞争抗原后相对于不加竞争抗原的对照孔所降低的OD值(△OD)与竞争抗原所结合掉的抗体量成正比，所以可以用降低的OD值(△OD)与对照孔吸收值OD0之比代表被结合的抗体量与总抗体量之比：

(1)

等式(1)中OD和OD0分别表示加有竞争抗原和不加竞争抗原时的吸收值，OD代表加入竞争抗原后光吸收值的变化，[Ab]为与竞争抗原结合的抗体浓度，[Ab]0是抗体的总浓度[6]见图6，。其中[Ag]0=7.4×10－10M2.5荧光免疫法检测血清EPO含量标准曲线的制定按1.2.6的方法，以相对荧光强度对EPO稀释倍数的对数作图，即得标准曲线，如图7所示。

2.6竞争ELISA法与荧光免疫法测定血清EPO含量对比分别对20例正常人血清用以上两种方法进行测定，结果的统计学比较如下：

3讨论

兴奋剂检测作为反兴奋剂的手段已成为各大赛事中必不可少的一项内容。EPO是国际奥委会禁用的肽类激素的一种，国际上还没有制定出EPO的检测方法[7～10]，但精确检测EPO浓度是确定其检测标准的首要条件。以单克隆抗体(McAb)为基础的免疫化学检测方法由于具有灵敏度高，特异性强，方便、快速等特点，成为EPO最具潜力的检测方法[11,12]。

近年来，藻荧光蛋白作为一种新型探针逐渐受到人们的重视，为检测提供新的有效途径。藻胆蛋白在钝顶螺旋藻中的含