摘要目的:探讨细胞凋亡在脑缺血再灌注时脑损伤过程中的作用。方法：采用免疫组化法检测大鼠脑缺血再灌注不同时间内c－fos、bcl－2蛋白表达的水平。结果：(1)脑缺血再灌注时在缺血侧皮层和基底节区可见c－fos阳性表达，并于缺血30min再灌注1h时阳性表达达高峰；(2)脑缺血再灌注时缺血侧皮层和基底节区均有bcl－2阳性表达，并随再灌注时间不同，其阳性表达率亦不同。于缺血2h再灌注3h时阳性表达达高峰。结论：c－fos和bcl－2参与大鼠脑缺血再灌注时缺血性细胞损伤(包括细胞凋亡)的发生。

中图分类号R743.3文献标识码A文章编号1007－5496(2000)05－0692－02

The protein expression of c－ fos and bcl－ 2 in rats after focal cerebral ischemia followed by reperfusion

WANG Xiu-zhen

(Cast Machinery Factory Staff Hospital Qingdao,Qingdao 266021， China)

WANG Chun-xia.

(Cast Machinery Factory Staff Hospital Qingdao,Qingdao 266021， China)

Abstract Objective:To investigate further the effect of apoptosis on brain injury in reperfusion after cerebral ischemia.Methods:Changes in protein expression of c－ fos and bcl－ 2 after focal cerebral ischemia followed by reperfusion were detected by immunohistochemical method.Results:(1)Expression of c－ fos positive cells was found after cerebral ischemia followed by reperfusion in the ipsilateral cortex and basal ganglia area,and reached a peak level at 1 h reperfusion after 30 min cerebral ischemia.(2)Expression of bcl－ 2 positive cells was found in ischemic cortex and basal ganglia area after cerebral ischemia followed by reperfusion,and the level of positive expression varied to the duration of reperfusion,and reached the peak level at 3 h reperfusion after 2 h cerebral ischemia.Conclusion :The protein expression of c－ fos and bcl－ 2 participated in the occurance of ischemic cellular injury,including apoptosis ,caused by cerebral ischemia followed by reperfusion in rats.

Key words cerebral ischemia;reperfusion;c－ fos;bcl－ 2

研究表明，缺血性脑组织损伤有两种形式：缺血性坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis)。脑缺血时伴有多种凋亡相关基因和蛋白的表达，提示细胞凋亡机制参与了缺血性损伤的形成。凋亡相关基因通常分为两类:一类是促凋亡基因，如c－fos,c－jun、c－myc、p53、bax、fas等；另一类是抗凋亡基因，如bcl－2,bcl－x1等。本文旨在用免疫组化方法检测脑缺血再灌注损伤过程中c－fos和bcl－2蛋白表达的变化，探讨脑缺血再灌注时细胞凋亡的基因调控机制。

1资料与方法

1.1动物模型制备及分组健康雄性SD大鼠，体重250～300g，共80只。腹腔注射3.6％水合氯醛(3.6mg/kg)麻醉后，采用右侧颈部切口，分离出右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA及其分支，结扎CCA近心端，于CCA近分叉处切口，插入4－0尼龙线(头端加热成光滑的球形)。栓线插入深度为(18.5±0.5)mm。需再灌注时，轻轻提拉所留线头至有阻力时表示尼龙线头端已至CCA切口处，则再灌注模型形成。术中室温保持在(22±2)℃。

动物分组：随机将大鼠分成以下3组：(1)脑梗塞体积组(n=8)。(2)c－fos组：假手术组(n=4)，缺血30min不灌注组(n=8)，再灌注30min组(n=8)，再灌注1h组(n=8)，再灌注6h组(n=8)。(3)bcl－2组：假手术组(n=4)，缺血2h再灌注1h组(n=8)，再灌注3h组(n=8)，再灌注6h组(n=8)，再灌注12h组(n=8)。

1.2脑梗塞体积的检测法将大鼠缺血6h后断头取脑，切去额极，间隔2mm连续作A、B、C、D、E共5个脑组织冠状切片，将切片立即置于2％红四氮唑(TTC)磷酸缓冲液中避光、37℃恒温孵育30min。采用病理图像分析仪(北京航空航天大学图像中心制造)测量脑梗塞面积，根据梯形法则计算脑梗塞体积。

1.3c－fos、bcl－2的免疫组化检测法将实验大鼠于缺血再灌注后，开胸暴露心脏，从左心室灌注肝素化生理盐水(50μ/ml)250ml，剪开右心房，将血液冲洗干净，然后应用4％多聚甲醛250ml心脏灌注固定。断头取脑，自额极至枕叶分为A、B、C、D、E共5等分，取C脑片置冰冻切片机内行冠状切片，片厚15μm。免疫组化染色采用SP法。c－fos、bcl－2免疫组化试剂盒购于北京中山生物试剂有限公司，抗体浓度为1：50。

结果判断：采用病理图像分析仪，观察并计数阳性细胞。显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。每张切片中采集10个具有代表性的高倍视野，其中大脑皮层5个，基底节区5个，每个视野中细胞总数不少于100个，尔后计算阳性率。阳性率=阳性细胞数/(阳性细胞数＋阴性细胞数)×100％。

1.4统计学处理应用STATA软件包进行统计分析。各组阳性率以百分数(％)表示，组间比较采用χ²检验。

2结果

2.1脑梗塞体积经TTC染色后，实验大鼠于右侧额、顶叶皮层及尾壳核区出现边界清晰、范围较恒定的苍白梗塞灶，经计算机图像分析仪测量脑梗塞面积，根据梯形法则算得脑梗塞体积为(198.79±28.36)mm³。

2.2脑缺血再灌注时c－fos表达的变化免疫组化结果发现：脑缺血再灌注时缺血侧皮层及基底节区c－fos表达显著增多，且其表达水平随再灌注时间不同而有所变化。缺血30min不灌注组，皮层和基底节区即可出现c－fos表达增多，阳性率分别为16.97％和17.82％；再灌注30min组，阳性率分别上升至22.60％和23.71％；再灌注1h组，c－fos表达达高峰，阳性率分别为34.61％和35.64％，与不灌注组相比，均有显著性差异(χ²=52.684～420.558,P＜0.001)；再灌注6h组阳性率明显下降，分别为19.49％和18.14％，与不灌注组相比，皮层阳性率仍显著增高(χ²=10.541,P＜0.01)，而基底节区已无显著性差异(χ²=0.179，P＞0.05)。假手术组及对侧非缺血区的皮层和基底节区仅有极少c－fos阳性表达。

2.3脑缺血再灌注时bcl－2表达的变化假手术组及缺血再灌注组非缺血侧大脑半球未见bcl－2阳性表达。缺血再灌注组在缺血侧皮层和基底节区均有bcl－2阳性表达，但随再灌注时间不同，其阳性表达率亦不同。缺血2h再灌注1h组阳性表达较少，皮层和基底节区的阳性表达率分别为14.03％和14.24％；再灌注3h组阳性表达达高峰，阳性率分别为21.47％和23.39％；再灌注6h阳性率下降，分别为19.77％和21.66％；而再灌注12h组阳性率分别降至13.86％和15.95％。再灌注3h、6h组各与再灌注1h组相比，均有显著性差异(χ²=78.233～174.681,P＜0.001)；再灌注12h组与再灌注1h组相比，基底节区仍有显著性差异(χ²=7.850,P＞0.01)，而皮层区无显著性差异(χ²=0.079，P＞0.05)。

3讨论

本文采用大鼠大脑中动脉(MCA)线栓法制成局灶性脑缺血再灌注动物模型，经TTC染色证实MCA分布区可见缺血灶，表明该模型方法简单、可靠，重复性好，适用于MCA缺血再灌注的病理机制研究。

3.1c－fos基因与脑缺血再灌注c－fos基因是FBJ和FBR小鼠成骨肉瘤病毒中致癌基因v－fos的细胞同源序列，其核苷酸顺序已经明确。在正常情况下，c－fos基因在绝大多数细胞包括神经元中仅呈极低水平表达。许多细胞外刺激如癫痫、脑缺血均能诱导细胞内c－fos快速而短暂地高水平表达，它是即早基因的一种。

本实验结果表明，脑缺血再灌注时可诱导c－fos表达增多，并于再灌注1h时c－fos表达达高峰，再灌注6h组阳性表达下降，基底节区已降至再灌注前水平，而皮层区阳性表达仍偏高，二者之间的差别可能与皮层神经元对缺血耐受性差有关。分析c－fos表达增多的机理，可能与以下因素有关：(1)脑缺血再灌注时EAA释放增多，N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受体激活，从而诱导c－fos表达^[1],而NMDA受体拮抗剂可部分阻断c－fos的表达^[2]。(2)脑缺血再灌注时细胞内Ca^2＋超载，可诱导c－fos表达，而钙通道阻断剂可抑制c－fos表达。细胞内Ca^2＋超载通过激活磷脂酶A2、环氧化酶、蛋白激酶与钙调蛋白结合，激活Ca^2＋/Cam激酶，通过对转录因子进行磷酸化修饰等途径诱导神经细胞c－fos表达^[3]。(3)脑缺血再灌注时产生的大量氧自由基，对细胞膜的不饱和脂肪酸诱导过氧化反应，产生过氧化脂质，从而损伤细胞膜、细胞器和酶功能^[4]。自由基可使DNA与RAN产生一系列变化，从而影响信息传递、转录和复制。(4)NO能引起细胞的凋亡。脑缺血及再灌注时缺血脑组织的NO含量明显升高，可达基线水平的100倍^[5]。Bonfoco^[6]的实验发现，皮层神经元暴露于短时间或低浓度的过氧亚硝酸盐环境，能诱导以凋亡特征为主的迟发性神经毒性反应。

总之，脑缺血再灌注时兴奋性氨基酸、Ca^2＋超载、自由