摘要：基因治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的研究是神经科学领域的热点之一。靶基因的导入可以增加多巴胺的合成，降低多巴胺神经元的死亡。靶基因编码多巴胺合成途径中重要的酶如酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)和芳香族氨基酸脱羧酶(Aromatic L－Aminoacid Decarboxylase,AADC)以及神经元保护分子如神经营养因子和抗凋亡蛋白。基因的导入主要有2种方式：直接转移(InVivo)和离体转移(ExVivo)。本文综述了不同的基因转染系统。虽然目前PD的基因治疗还停留在实验室阶段，但现有的结果是令人鼓舞的。

分类号：R742.5文献标识码：A

文章编号：1007－5496(2000)03－0329－03

Recent progress in the study of gene therapy of Parkinson's disease

LUO YongLIANG Xi-binWANG Xiao-min.

（Neuroscience Research Institute,Beijing Medical University,Beijing 100083,China）

Abstract：Gene therapy is being explored as an effective strategy to restore and protect neuronal function in the substantia nigra.Candidate genes include those that either can augment dopamine biosynthesis such as tyrosine hydroxylase(TH)and aromatic L_amino acid decarboxylase(AADC)or attenuate loss of dopaminergic neurons such as neurotropic factors and anti_apoptosis proteins,Two primary approaches for gene transfer have been explored :in vivo and ex vivo.Various gene transfer systems have been postulated .Although all of them are still at the stage of laboratory experiment,the attained results appear quite promising.

Key words：Parkinson's disease;gene therapy;neurotropic factor;tyrosine hydroxylase

60年代开始的左旋多巴(L－DOPA)替代疗法一直是治疗帕金森病((Parkinson'sdisease,PD)的主流，虽然在一定时期内(3～5年)可明显改善症状，但此法不能减慢疾病的进程，而且随着长期用药和疾病的发展，效果进行性下降，且副作用日趋严重，不能根本解决问题。80年代初开始将自体肾上腺髓质或胚胎黑质细胞移植于脑内，收到一定效果，但细胞来源困难，价格昂贵以及伦理问题等限制了其在临床的应用。80年代末，随着基因治疗概念的不断深入，基因治疗技术日趋成熟，人们开始了对PD基因治疗的尝试。1989年，Wolff用带有酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)cDNA的逆转录病毒载体体外转染纤维母细胞株，并将此工程细胞植入6－OHDA损伤PD模型大鼠尾核，不仅表达出有活性的TH，而且脑内多巴胺的含量明显升高，症状也得到改善^[1]，为PD的基因治疗首开先河。

1基因治疗有望成为防治PD的有效方法

PD是中枢神经系统退行性疾病基因治疗的首选疾病。这是因为其病理改变基本明确，相关的基因已经克隆且有恰当的动物模型，定点转基因的解剖学位置清楚便于立体定位注射。因此近几年PD基因治疗已取得不少进展。

PD基因治疗的主要策略包括两个方面：在病变黑质部位导入参与L－DOPA及多巴胺合成、影响多巴胺代谢的生物分子，增加多巴胺在纹状中的合成，弥补黑质、纹状体系统中DA含量的不足而起到治疗作用；在病变部位导入防止多巴胺神经元死亡或促进濒死神经元功能恢复的保护基因，从而防止病情的恶化以及减轻症状。TH是DA合成的限速酶，可将酪氨酸转化为L－DOPA，L－DOPA，经芳香族氨基酸脱羧酶(AromaticL_aminoAcidDecarboxylase,AADC)脱羧成为重要的神经递质DA。PD患者由于脑内TH和AADC的活性下降，DA降低而发病。因此设法提高TH及AADC的活性可促进L－DOPA的生成，从而使DA的含量及释放量增加。往脑内导入TH及AADC基因，使之高效、稳定地表达是可行的方法之一。另外，多种神经营养因子均被证明对DA能神经元有明显的保护作用。其中GDNF对DA能神经元的保护作用相对特异及显著^[2]。目前PD基因治疗的研究趋势为将上述两个方面结合起来，治疗和预防双管齐下，这无疑是PD基因治疗的最佳策略。可以相信，这种考虑将成为日后PD基因治疗的发展方向。

PD的基因治疗主要分为两个途径：(1)离体转移(exvivo)途径，通过移植携带靶基因的工程细胞完成。(2)直接转移(invivo)途径，包括病毒途径和直接的DNA转移途径，即用复制缺陷的重组病毒把基因带入体内或直接把裸DNA导入体内。

2Ex Vivo法治疗PD

Ex Vivo法是一种间接的基因转移与治疗途径，即在体外先通过磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导或应用病毒载体等方法把含目的基因的表达载体转染至载体细胞，得到表达靶基因的工程细胞，再把工程细胞植入体内，对疾病进行治疗。工程细胞的遗传组成相对较清楚，在适合的启动子的控制下，能够观察到转入基因的长时程表达。把工程细胞移的制备与细胞移植技术结合起来，可以克服单纯移植治疗神经系统疾病过程中移植组织供应不足和免疫排斥等诸多问题。ExVivo法比较经典、安全，而且效果较易控制，但缺点为步骤多，技术复杂，难度大，不易推广^[3]。

2.1载体细胞通常使用的载体细胞分为细胞系、原代神经元及原代非神经元3大类。(1)细胞系的优点是细胞能在体外生长与繁殖。但由于这些细胞不存在接触抑制，移植入体内后有成瘤的危险，并且源于异体细胞的免疫排斥严重地影响了此方法的安全性及治疗效果，但用retinoicacid处理过的人胚胎癌细胞系NT－2可分化为分裂后神经元样细胞，这种细胞移植入大鼠尾核6个月后表现为完全成熟的神经元表型。不过，实验中仍然观察到排斥反应的发生。另外，应用半透性微囊包裹技术也可很大程度地缓解上述问题。(2)采用原代神经元细胞相对安全，但细胞难于获得，在体外较难培养，并且不易被经典的方法转染；神经元前体细胞是最理想的细胞，因为在生长因子的作用下神经元前体细胞能不断生长与繁殖。这样，就较易用经典途径转入目的基因。而且在种入体内后能根据所处环境分化成相应细胞，并与宿主形成突触联系。(3)原代非神经元细胞也被广泛采用。原代纤维母细胞常被用于携带神经递质基因与神经营养因子基因。使用自身纤维母细胞能避免免疫排斥，但操作不适也可以导致肿瘤的发生。原代肌细胞易于用化学法或病毒法转基因，种入脑后，可以长时程表达目的基因。肌细胞能够来源于患者自身，避免免疫排斥，但对其稳定性以及成瘤性需作进一步探讨。目前人们对中枢来源的星形细胞比较感兴趣。Lundberg等用逆转录病毒载体经TH基因转染星形细胞再植入PD大鼠纹状体内，可改善其旋转行为约2～3周，并证实了TH的表达^[4]。Azizi等将用塑板贴附法分离的人骨髓基质细胞(humanmarrowstromalcells,MSCs)直接注入大鼠的纹状体。结果显示，移植后的MSCs在脑内的存活方式类似于星形细胞。这种细胞来源容易，可从自体骨髓中分离，且易于体外培养扩增，是很有前途的载体细胞之一。

2.2靶基因用于PD治疗的靶基因主要为TH基因与神经营养因子基因，在exvivo法中均得到应用，并取得了一定效果。还有其他一些基因也有报道。

2.2.1TH基因将TH基因转入细胞系进行PD的基因治疗已经取得一定疗效。但成瘤性限制其临床应用。Anton等将携带TH基因的逆转录病毒或质粒表达载体导入温度敏感性的黑质神经细胞系，并移植入大鼠及灵长类PD动物模型，在两个月内减轻了动物模型的症状，未检测到肿瘤的产生^[5]。Tornatore等利用人胚中枢神经系统来源的细胞建成一种星形细胞系，把THcDNA转入其中筛出稳定表达的克隆，它不仅能表达TH，而且还保持着星形细胞的营养潜能。植入PD大鼠模型后，大鼠的旋转行为异常明显改善。随后的四周内逐渐回到治疗前水平，这主要由于移植细胞为异种细胞，可被免疫系统识别和杀伤所致^[6]。O'Malley和Geller用表达大鼠THcDNA的逆转录病毒载体感染鼠施旺细胞系，发现L－多巴的分泌量比成纤细胞系中增加两倍多，为其进一步应用奠定了基础^[7]。

原代细胞没有恶性表型，可以大大增加安全系数，颇受欢迎。使用最多的是原代纤维母细胞，用Fishcher大鼠皮肤纤维母细胞类的原代细胞作为载体，分别转入TH基因或自体AADC的cDNA均观察到在治疗PD中的应用前景。Jiao等将含有TH的表达质粒在脂质体介导下转染的肌母细胞和肌管细胞共同移植入PD大鼠的纹状体，能够高水平稳定地表达6个月，阿朴吗啡诱发的旋转次数减少了75％^[8]。首都医科大学徐群渊等把携带TH基因的肌工程细胞移植入中脑，在治疗PD中已见成效。

2.2.2神经营养因子基因用神经营养因子基因治疗PD的主要目的有二：(1)通过神经营养因子基因的产物保护易受损的自体DA能神经元。(2)通过神经营养因子来保护移植的外源工程细胞，改善其状态，延长其生存时间。

往纤维母细胞中转入BDNF基因，或往原代新生鼠I型星形细胞中转入的BDNF基因，种入不同的模型动物，观察到了行为学的改善或对DA能神经元的保护^[9]。北京医科大学神经科学研究所将GDNF基因转入NIH3T3细胞，与原代中脑细胞共培养，观察到明显的预防DA能神经元退变及抵抗MPP＋损伤的作用。他们还把GDNF基因转入一株称为MN9D的中脑DA能神经元细胞系，使其具有同时分泌DA和GDNF的能力，从而把DA及GDNF结合起来，体现出防治兼顾的特色。体外研究发现该M