随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)从1990年建立后，已广泛应用于生命科学的各个领域。AP-PCR的基本原理是在比较低的退火温度下，随机引物可与模板上具有重复同源区的序列位点结合，并存在错误配对。如果两个结合位点分别存在于两条DNA链上，并且两个位点的距离约数百乃至几千个碱基对，那么这两个位点之间的序列是可以扩增的。当所采用的引物能与模板结合，形成一些可扩增序列，经过PCR扩增和凝胶电泳后，即可产生指纹图。其产物的多态性遵循孟德尔定律^［1，2］，其同源片段数目与样品之间的亲缘关系成正相关^［3］。这一理论可用于耐药菌株的流行病学监测，且具有方法快速、经济、简便的优点，但影响因素很多，需严格优化试验条件。

一、材料与方法

1.细菌来源：8株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)由长海医院临床微生物室提供，采用多重PCR的方法鉴定^［4］，均为凝固酶阳性。金葡菌标准株(ATCC25923)由上海市临床检验中心提供，为苯唑西林敏感株。

2.DNA提取：使用细胞基因组DNA快速抽提纯化试剂盒(上海华舜公司提供)提取细菌DNA，操作按说明书进行。

3.随机引物合成：P1 5′GCACGTTAAGAGTGGGTTGG 3′；P2 5′GCGAGTGGGGTCAGTGAATGAA 3′； P3 5′CAATCGTCCGT 3′^［5，6］。由上海生工生物工程有限公司合成。

4.PCR扩增及产物分析：按照标准PCR方法进行，不同的是每次只采用一条引物和低于40℃的退火温度，置DNA扩增仪(博士舰 上海博通科技公司)扩增。取产物8 μl经18 g/L琼脂糖凝胶电泳，0.5×TBE电泳缓冲液，50V电泳3 h，溴化乙啶染色，透射式紫外分析仪观察并拍照，采用GeneRuler 100 bp DNA梯度的DNA参照标准(MBI产品)作为分子量参考物。

二、结果

1.镁离子浓度对AP-PCR影响：在其他扩增条件不变的情况下，改变镁离子浓度(范围1.5～6.0 mmol/L，递增梯度为0.5 mmol/L)，观察指纹图的变化。分子量小DNA片段随镁离子浓度的增加而被扩增；分子量较大的DNA片段随镁离子浓度的增加而被抑制。MgCl₂浓度在2.5～4.0 mmol/L时，分子量大和小的DNA片段都能得到很好地扩增。

2.模板浓度对AP-PCR影响：固定其他扩增条件，改变模板浓度(0.07～46.5 ng/μl)，观察DNA指纹图。结果模板浓度在0.15～1.16 ng/μl之间指纹图一致，且分辨力好，模板浓度过高或过低均显著影响扩增效果，甚至不出现扩增产物。

3.引物浓度对AP-PCR的影响：通过对引物浓度的调节，发现在0.42～0.74 μmol/L的范围内扩增效果最佳且没有二聚体，3条引物的结果一样。

4.退火温度的选择：在改变退火温度时，以P1、P2为引物的扩增效果无明显差异，为25℃最佳；以P3为引物时，退火温度为35℃最佳。

5.菌株体外传代对AP-PCR谱型的影响：将1株金葡菌在LB液体培养基中传代，每天1次，每次18 h，共10次。其培养物提取的DNA经AP-PCR扩增，它们的谱型完全相同。

6.3条引物的AP-PCR分型的影响：以P1、P2、P3为引物均能达到分型的效果。但以P1为引物，指纹图中的DNA片段的分辨力最好。

7.上述各条件下的每次试验重复3次电泳图谱基本一致。

综上所述，AP-PCR法对金葡菌分型的最佳条件为：反应总体积50 μl，以P1为引物，其终浓度为0.528 μmol/L，10×Buffer 5 μl，MgCl₂浓度为2.5 mmol/L，4×dNTP为200 μmol/L，TaqDNA多聚酶2U(MBI产品)，模板量30 ng。94℃预变性4分钟，94℃变性1 min；25℃退火5 min；74℃延伸4 min，35个循环后再74℃延伸5 min。以上最佳条件对8株MRSA菌株进行AP-PCR分型(图1)。比较其多态性，可分5个AP-PCR型，SA-1为A1型，SA-2、SA-3、SA-4、SA-7为A2型，SA-5为A3型，SA-6为A4型，SA-8为A5型。

1～8：为MRSA株；M：100 bp DNA；ATCC：25923金葡菌标准菌株

18株MRSA的AP-PCR谱型

三、讨论

AP-PCR指纹图的清晰程度、条带的数目、位置和稳定性与所用引物的长度、序列和浓度、退火温度、镁离子浓度、TaqDNA多聚酶使用量及活性、模板浓度等诸多因素有关。已有人对革兰阴性菌AP-PCR分型的影响因素作过探讨^［7，8］。由于革兰阳性菌和革兰阴性菌在生物学性状上存在差异，因此在AP-PCR分型时实验条件的选择也有所不同。随镁离子浓度的增加，分子量大的DNA片段被抑制，分子量小的DNA片段被扩增，而革兰阴性菌的电泳图谱正好相反。因此在选择镁离子浓度时，为了图谱清晰，条带较多且稳定，重复性也好，革兰阳性菌镁离子浓度选2.5 mmol/L，革兰阴性菌选4.0 mmol/L。至于其他影响因素，我们没有发现质的不同。本试验还证明，在保证热循环仪良好的热控制装置的前提下，在同一实验室里，选择最佳的固定不变的试验条件时，AP-PCR分型的重复性及分辨率都很好。由此可见，AP-PCR分型虽然有很多影响因素，但只要有效控制好试验条件，它将会给病原菌的流行病学监测和临床诊疗提供可靠的依据。

基金项目：宜昌科委科学资助(E 99305)

参考文献

1Welsh J，McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nusleic Acids Res, 1990,18:7213-7218.

2Welsh J, McClelland M. The characterization of pathogenic microorganisms by genomic fingterprinting using arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR). In diagnostic molecular microbiology, 1993,595-602.

3Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Res, 1990,18:6531-6535.

4郑波，李家泰.多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌.中华医学检验杂志，1999，22：145-148.

5Belkum V, Kluytmans J, Leeuwen, et al. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR for typing of staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol, 1995,33:1537-1547.

6Antonio O, Juan JC, Jose MN, et al. Application of an optimized and highly discriminatory method based on arbitrarily primed PCR for epidemiologic analysis of methicillin-resistant staphylococcus aureus nosocomial infections. J Clin Microbiol,1998,36:1128-1134.

7高瞻，Jackson K,Leslie DE.随机引物多聚酶链反应对革兰阴性菌分型的影响因素研究.中国卫生检验杂志，1996，6：275-278.

8郭永建，朱忠勇.铜绿假单胞菌随机扩增多态性DNA指纹法分型基因分型研究.中华微生物学和免疫学杂志，1997,7:309-313.

收稿日期：1999-08-09