逆转录-巢式聚合酶链反应（RT-PCR）是快速直接的丙型肝炎病毒（HCV）感染诊断方法，但繁琐，易外源性污染造成假阳性结果。我们以蜡隔介导高温启动，优化各反应条件，使在一个Eppendof（Ep）管中依次连续地进行常规的三步反应，从而可以防止外源性污染，快捷高效地进行RT-PCR检测。

一、材料和方法

1.标本来源：取60例血液透析患者血清标本。标准阳性血清由北京医科大学人民医院肝病研究所提供。

2.试剂：鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶（GIBCO）；TaqDNA聚合酶(加拿大)；蜡丸（熔点60℃，PE）；HCV PCR诊断试剂盒（华美）。

3.引物：根据HCV基因5′ 非编码区序列^［1］自行设计：逆转录及半巢式PCR共用反义引物P1：5′-TTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTA-3′；正链外引物P2： 5′-TGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3′；正链内引物P3：5′-GAAAGCGTCTAGCCATGG-3′。

4.方法：(1)RNA抽提：采用异硫氰酸胍-酸酚一步法提取血清中病毒RNA^［2］。(2)RT-半巢式PCR单管法：在0.5 ml Ep管中，加入PCR反应缓冲液，其中包含：P2和P3及5U Taq DNA聚合酶，终体积70 μl。加入蜡丸1粒于反应液中，70℃孵育2 min使其融化，然后冷却至室温使蜡层凝固。向Ep管中再加入逆转录反应缓冲液，其中包含1U核糖核酸酶（Rnase）抑制剂，2.5U M-MLV逆转录酶，10 μl模板RNA，P1等共30 μl共存于凝固的蜡层上，封闭Ep管。反应参数为：37℃逆转录30 min；94℃10 min，灭活逆转录酶，同时蜡层融化,上下两部分试剂混合，模板cDNA预变性；90℃变性1 min，70℃1.5 min,较长的正链外引物（31 bp）与通用的负链引物复性及延伸，90℃变性1 min，50℃1 min，较短的正链内引物（18 bp）与通用负链引物复性，70℃延伸1 min,共循环20次。所有操作过程均采取严格的防范措施^［3］。扩增产物经2%凝胶电泳后与DNA分子量标准比较,出现特异性336 bp条带即可判定为阳性结果。(3)常规RT-巢式PCR三步法：按试剂盒说明书操作。

二、结果

1.HCV RNA检出率：60份血清标本中，单管法共检出30份HCV RNA，而三步法则测得32份阳性结果。经重复试验，确证后者含2例假阳性结果，可能系由外源性污染所致。

2.灵敏度与特异性：当高滴度的标准阳性血清经小牛血清梯度稀释，本方法可检出的最高稀释倍数为10⁶倍,与三步法相同；同时检测甲型肝炎（HAV）IgM、乙型肝炎（HBV）DNA阳性血清、健康人血清阴性对照和逆转录酶空白对照均阴性。

3.重复性测定：分别取HCV RNA强阳性血清、弱阳性血清、健康人血清标本共8份贮存于-20℃，2 d测定1次，共10次，得到完全一致的结果。

三、讨论

本研究设计的RT-半巢式PCR单管法，由于使用了熔点60℃的蜡丸，而使逆转录酶和TaqDNA聚合酶在同一个Ep管中分别存在于蜡隔的上层和下层,并在各自适宜的反应体系中独立反应，此举既有利于两种酶最适反应条件的分别优化，又不需要在反应中途开盖添加任何试剂，从而大大降低了外源性污染的可能性，故比RT-PCR单管法先进。当逆转录反应完成后，反应温度升至94℃，因高于蜡丸熔点故蜡隔融化，逆转录酶随之灭活。由于两种体系混合后成分互补，经高温启动，Taq DNA聚合酶的活性及忠实性得以最大发挥。在PCR循环扩增体系中，正链外引物的长度要比正链内引物长，但浓度只有后者的百分之一，当在较高的退火温度条件下（70℃），较长的外引物比较短的内引物更容易与模板复性，故外引物介导的延伸反应得以进行；较高的退火温度及热启动程序也有助于提高整个反应的特异性和扩增效率。当在较低的退火温度条件下（50℃），高浓度的内引物与模板复性的几率要比低浓度的外引物大得多，以内引物为介导的PCR延伸反应占绝对优势。在20次循环后，产生了大量的336 bp的终产物。

RT-半巢式PCR单管法由高温启动，过程连续封闭，特异性高，其灵敏度与重复性与标准三步法相同，其思路普遍适用于临床各种RNA病毒的PCR检测，具有较高实用价值。

参考文献

1Bukh J,Purcell RH,Miller RH.Sequence analysis of the 5’noncoding region of hepatitis C virus.Proc Natl Acad Sci USA,1992，89：4942-4946.

2Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987，162：156-160.

3Kwok S,Higuchi R.Avoiding false positive PCR.Nature,1989,339：237-240.

收稿日期：1999-06-14