关键词： 螺杆菌；幽门；基因；结构；细菌；聚合酶链反应

【摘要】目的建立竞争性聚合酶链反应（PCR）定量检测幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白基因A（cagA）的方法。方法以重组PCR将乳糖操纵子中乳糖调节蛋白(LacI)的特异性结合序列（21 bp）插入cagA基因的一段序列（400 bp）中得到重组cagA基因片段(rfcagA)。体外克隆并表达谷胱甘肽转硫酶-LacI(GST-LacI)的融合蛋白，其一端具有GST活性，另一端可特异性地与rfcagA结合。在定量PCR中，以rfcagA为内参标模板，pMC3或Hp基因组cagA作为竞争性模板，PCR产物的5′-端标记了生物素，可与包被了亲和素的微孔板结合。只有rfcagA的PCR产物可与融合蛋白结合而显色。结果GST底物的显色程度与样本的cagA含量呈负相关，当反应体系中的起始模板量为10～10⁵拷贝，循环次数小于或等于20次,原始模板数以指数方式增长,并建立了原始模板的对数与A₃₄₀值间的标准曲线。用该方法检测14份已知菌液中的cagA，9份阳性,5份阴性，符合实际情况；cagA的拷贝数为6.3×10¹⁰～2.14×10¹¹/L。结论这是一项特异、敏感及实用的定量检测cagA基因的技术。

Quantitative detection of cagA of helicobacter pylori by competitive PCR

HAN Fengchan,YAN Xiaojun,SU Chengzhi.

Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, Xi′an 710033, China

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for quantitative detection of cytotoxin associated gene A (cagA) positive Helicobacter pylori (cagA⁺ Hp) by competitive polymerase chain reaction. MethodsThe lactose regulatory protein (LacI) specific combining sequence (the lactose operator, 21 bp) was inserted into the cagA fragment (fcagA, 400 bp) by overlapping extension PCR. By cloning lactose regulatory gene (lacI) into pGEX-4T-3, transforming E.coli JM109 with pGEX-4T-3/lacI, and inducing the bacterium with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside （IPTG）, we got the active fusion protein of glutathione-s-transferase (GST) and LacI. In the competitive PCR， rfcagA was used as the internal standard template and pMC3 that contained most part of cagA from the 5′-end or Hp cagA as the competitive one. Since one primer of the PCR was labelled with biotin at the 5′-end, the PCR products could conjugate to the microplate wall that coated with avidin. When the GST-LacI was added to the walls, only the products containing the lactose operator sequence could combine with it, and the GST could catalyze 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and glutathione to form a substance that had the maximal ultraviolet(340nm) absorbance. ResultsWhen the copies of the internal standard was fixed (100 copies), a standard curve of A₃₄₀ against the logarithmic value of the competitive templates was established. Using this method, we found that, among the 14 bacteria cultural media, 9 were cagA positive with the copies from 6.3×10¹⁰/L to 2.14×10¹¹/L. The coincidentce rate was 100%. ConclusionThis is a specific,sensitive and applicable method for quantitative detection of cagA.

【Key words】Helicobacter pylori;Genes, structural, Bacterial;Polymerase chain reaction

幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）在上消化道疾病的发生中起着十分重要的作用。现已确认Hp是慢性胃炎的主要病原菌，与消化性溃疡及胃癌的发生密切相关。自从公布了Hp 细胞毒素相关蛋白基因A（cytotoxin associated gene A， cagA）的序列以后，国内外学者对cagA阳性Hp的研究日趋深入。本研究拟建立竞争性定量聚合酶链反应(PCR)检测cagA基因的方法。

材料与方法

一、材料

1.材料：cagA阳性Hp菌株（ATCC53726）：美国Vanderbilt大学卜昕博士惠赠；Hp临床分离株10株：取患者胃粘膜活检组织，微需氧条件下培养。由第四军医大学西京医院消化内科及第一军医大学南方医院消化病研究所提供。pGEX-4T-3：本所保存；pMC3：为含cagA基因5′-端大部的pBluescript质粒，由美国Vanderbilt大学Tummuru博士惠赠。Taq DNA聚合酶：上海复华生物工程公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），华美公司；亲和素（分子量：66 000）：原平生物工程公司；还原型谷胱甘肽(GSH)：华美公司；1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）：北京化学试剂厂；Glutathione Sepharose 4B：Pharmacia公司；PCR扩增仪(Therolyne Amplitron Ⅱ)：Barnstead公司；373A型全自动DNA序列分析仪：PE公司；Bio-Rad mini-proteinⅡ电泳系统：Joss Bio-Lab公司；DU-640型核酸蛋白分析仪：Beckman公司。

二、方法

（一）内参标模板rfcagA的构建

1.PCR引物设计：根据已报道的cagA基因的序列^［1］及LacI蛋白的特异性结合部位的序列设计3对PCR引物：p1～p6。其中p1及p2用于扩增cagA基因中400 bp的片段，在p1之5′-端结合了生物素；用p3与p5、 p4与p6分别扩增400 bp cagA基因片段的两端。在p5的5′-端引入LacⅠ蛋白的特异性结合序列（21 bp），在p6的5′-端引入了p5的 5′-端21个碱基的反义DNA序列。

2.PCR反应及测序：参考文献进行PCR反应^［2］。以pMC3为模板，分别以p3和p5、p4和p6为引物做PCR，得到产物AB及CD。将AB和CD等量混合做重叠延伸PCR，得到产物AD（rfcagA），克隆入pUC19进行序列测定。

（二）融合蛋白（GST-LacI）的表达

1. lacI基因的克隆及表达：设计PCR引物（lacIp1: 5′-ACGTGAATTCGAAACCAGTAACTTTATAC-GATG-3′；lacIp2:5′-GTCGACCTCACTGCCCGCTTTCC-AGTC-3′），从天然大肠埃希菌DNA中扩增lacI基因。测序正确后将lacI基因克隆入表达载体pGEX-4T-3，转化大肠埃希菌（JM109），IPTG诱导GST-LacI融合蛋白的表达。12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察重组蛋白的表达。

2. 表达产物的变性、复性及纯化：GST-LacI包涵体的变性及复性参考文献进行^［3］。采用GST亲和层析法纯化GST-LacI。

(三) GST-LacI结合rfcagA的活性鉴定

将10 μl rfcagA (0.5 g/L)与10 μl GST-LacI（1.0 g/L）混合，37℃水浴30 min,在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳,溴化乙啶染色，观察rfcagA结合GST-LacI前后迁移速度的变化，同时以BSA作为对照品与rfcagA结合。

（四）竞争性定量PCR检测cagA基因方法的建立

1.PCR模板的制备：参照文献进行^［4］。Hp DNA按菌液体积的10³倍悬浮作模板。

2.亲和素包被聚苯乙烯微孔板：参考文献进行^［5］。

3.竞争性PCR扩增cagA片段：PCR反应的总体积为50 μl,其中dNTPs各0.2 mmol/L，引物p1及p2各0.2 μmol/L，竞争性模板5 μl，内参标模板(rfcagA) 100个拷贝，Taq DNA聚合酶2 U，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂。扩增条件为：94℃变性35 s,55℃退火45 s，72℃延伸60 s,循环次数分别为5次，10次，15次，20次，25次，30次，35次，40次，最后于72℃下再延伸2 min。

4.PCR产物的定量分析：将不同循环次数下扩增的PCR产物进行不同倍数（2～10⁵）的稀释（稀释液为0.1 mol/L马来酸，0.15 mol/L NaCl），加100 μl于聚苯乙烯微孔板中，室温放置20 min,弃去，用洗涤液洗板3次；加入GST-LacI 100 μl（25 μg）,放37℃水浴5 min，弃去，以洗涤液洗5次；加入于37℃预热的基质液（含0.1 mol/L GSH、CDNB及PB-pH 8.0）100 μl，置37℃作用1 min；立即将反应板放入60℃水浴10 min，取50 μl在分光光度计上（波长340 nm，比色杯光径1 cm）测A₃₄₀值。同时设空白、阳性、阴性及标准品对照。

结果

1.内参标模板rfcagA的构建：对重组PCR产物做1.7%琼脂糖凝胶电泳，可见大小约400 bp条带，与预计大小相符(图1)。测序表明其一级结构完全正确。

1、2、3：rfcagA；4：PCR DNA参照标准

1重组内参标模板凝胶电泳结果

2.融合蛋白（GST-LacI）的表达：(1)lacI基因的制备：lacI基因的PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，可见一大小约为1 081 bp的片段(图2)。序列测定结果与已知的序列一致。(2)lacI基因的表达：在IPTG(0.5 mmol/L)诱导下，pGEX-4T-3/lacI转化菌（JM109）表达分子量62 000的融合蛋白（GST-LacI）, 诱导4h表达量达最大，占菌体蛋白的27%(图3)。 该蛋白主要以包涵体的形式存在，对其<