随着热稳定DNA多聚酶的发现，聚合酶链反应(PCR)技术发生了革命性的飞跃，使得其应用于临床成为可能，为医学检验及其研究提供了新的手段。已用于临床的PCR方法至今大都为定性分析，既无标准对照，也无质控，其最终产物用电泳法鉴定容易产生非特异性条带，结果重复性差，可靠性低，因而给临床诊断带来混乱。由于定性没有量化指标，所以无法用于疾病随访和疗效观察。如何提高灵敏度和稳定性，并能对样品中的DNA和RNA进行定量分析是迫切需要解决的课题。

一、目前临床采用的几种PCR定量测定方法

1.固体捕获技术的运用。(1)PCR-酶联化学发光法：Marrin等^［1］用固相捕获技术和酶联化学发光方法进行PCR定量。所有的反应均在微孔板上进行。由于引物上标有生物素，因而PCR产物上也标有相对量的生物素，它能定量地被链霉亲和素包被的微孔板捕获，然后用一荧光素标记的寡核苷酸探针杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体，再加入化学发光底物，用发光仪检测其光信号，与标准曲线对照定量DNA或RNA。(2)荧光标记引物法：Londgraf等^［2］将一对引物分别标记生物素和荧光素，扩增后得到5′端分别标有生物素和荧光素的双链扩增产物，其中标有生物素的一端被包被有链霉亲和素的微孔板吸附，另一端的荧光素被激发后发光，根据荧光强度定量DNA。(3)PCR-酶联免疫吸附法(ELISA)：地高辛或生物素或荧光素标记引物，扩增后的DNA产物即标有地高辛或生物素或荧光素。该产物被固相板上特异的探针(用生物素链霉亲和素交联在板上)所结合，再加入抗地高辛或生物素或荧光素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色^［3］。

以上3种方法均是对固相免疫定量分析技术的灵活运用，尤其第3种方法只需热循环仪和酶标仪，因而应用最广，如何将这一过程自动化是一个发展方向。

2.荧光双标记探针法：其原理是利用Taq酶的5′端外切酶活性。扩增时在加入特异引物的同时加入一荧光探针，该探针为一寡核苷酸，标记有一个荧光基团和一个熄灭基团，扩增时，每形成一条DNA链即有一双标记探针被偶联，Taq酶切去其荧光基团，其与熄灭基团分离。即每扩增一条DNA链，溶液中就增加一个荧光分子，即时或扩增后监测荧光强度，即时与标准曲线相比定量(Q)PCR^［4］。现已有将此方法研究成的专利产品，并发展了专用仪器ABI-7700仪器。

3.内参照法：在不同的PCR反应管中加入已知量的内标和引物，内标用基因工程方法合成，上游引物用5′-荧光标记，下游引物未标记，在模板扩增的同时，内标同时被扩增，在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物很容易用电泳或高效液相(HPLC)分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量mRNA^［5］。

4.竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源性竞争性模板。在同一试管中，待测样品与竞争模板用同一对引物(其中一个引物为荧光标记)同时扩增。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物将在内切位点处裂解为两个片断，而待测样本的产物不变，从而被区分(电泳，HPLC等)，通过荧光强度测定可与竞争物比较。两模板长度类似，扩增效率相近，由于竞争模板为已知量，可推测待测RNA含量^［6］。

二、定量PCR的临床应用

1.在传染性疾病方面的应用。(1)人类免疫缺陷病毒(HIV)：Atkins等^［7］用QRT-PCR研究HIV感染者对叠氮胸苷(ZDV)的抗性是由于其反转录酶的41、67、70、215处发生了点突变，有助于解释对ADT的耐药性，可用于HIV治疗方案的设计；Tetali等^［8］通过测定HIV-RNA的浓度，发现血浆中病毒量与疾病进展和存活率的关系，并可早期检出无症状携带者。(2)丙型肝炎病毒(HCV)：Roth等^［9］用定量逆转录(QRT)-PCR检测血清中HCV-RNA含量和HCV基因分型，认为是预测和监视α-干扰素治疗的重要指标。Casanovas等^［10］用QRT-PCR检测出血清中HCV-RNA含量高的母亲传染危险率大于平均垂直感染率(12%)。(3)乙型肝炎病毒(HBV)在乙肝的治疗过程中，慢性肝炎治疗终点的血清学标志即为HBV-DNA的消失。研究发现，可以HBV-DNA血清浓度的变化来评价药物疗效与病毒载量的关系^［11］。一般定性PCR已不能满足临床的需要，必须进行定量PCR测定。

2.定量mRNA。传统方法的灵敏度均达不到检测低表达mRNA的要求，因一些编码受体和内部信息分子的mRNA，由于其拷贝数极低，只能用QRT-PCR方法，通过在不同反应管中加入内标，控制RT-PCR的扩增效率才能精确测定mRNA水平^［5］。早在1988年Rappolce等人就将此法用于TGF-αmRNA表达水平分析。

3.肿瘤研究。Cairns等^［12］在考察原发性膀胱癌病中，用定量PCR检测P₁₆(DPS1752)的拷贝数，可测出80%原发膀胱癌，而用微卫星法检测同一序列只能检出50%，而且其速度远慢于前者。免疫组化(ICC)法作为检测病人血中、骨髓中极少量的乳腺癌细胞指标假阴性率大于50%，而用RT-QPCR灵敏度特异性均超过ICC法，所以它最大的用处在于排除ICC中的假阴性，代替ICC监测肿瘤患者的肿瘤最小残留量(MRD)的存在^［13］。Waha等在细胞基因的分析中使用了竞争性逆转录PCR法，他们已成功地用此方法分析人脑瘤中Fas受体、核因子(NF)-2、β₂-微球蛋白基因的表达。

4.人类基因组计划中，用定量PCR可同时检测多种基因，比单独检测每一个基因提供更多有效的信息^［14］。

三、存在的问题

尽管定量PCR技术在国内外都得到了很大发展，但因为仍有不少问题无法解决，因而如何能达到绝对定量仍是各国科学家努力的方向。首先即为标准品或(和)质控的制备。其制备有两种办法：(1)将所检测片断的重组质粒精确制成标准品。此方法的缺点在于病毒的提取过程无法定量，因病毒的破壁、释放及游离过程受多种因素的影响。(2)以已知量的病毒血清作为标准品，因无法绝对定量也只是相对定量。其次在量化分析模板的扩增产物时，如果一旦进入“平台期”将不利于以后的产物检测，因为产物的生成量和模板量不呈一定相关性。有人采用控制循环数，使扩增反应在进入平台期即终止。但无统一的标准，也无法绝对定量。

作为理想的PCR定量方法应具备以下条件：操作简便，反应时间短，结果判定简便客观、灵敏、特异，并且能够在将来应用于自动化分析系统。化学发光，荧光免疫技术比酶免疫法具更高的灵敏度，更宽的线性测定范围，因而固相捕获技术在定量PCR技术上的研究方向，具有更高的应用价值^［3］。

参考文献

1Martin CS, Bulter L, Bronstein I. quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 1995, 18:908-913.

2Landgraf A. Use of a fluorescence-PCR reaction to detect genomic sequeuce copy number and transcriptional abundance genome methods. Annual Biochem, 1991,193:231-233.

3仝文斌，高巍，费然，等.核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法.中华医学检验杂志，1999，22： 83-86.

4Lie Ys, Petropoulos CJ. Advances in quantitative PCR technology: 5′ nuclease assays. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9: 43-48.

5Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitation of messenger RNA by competitive polymerase chain rection. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38:133-140.

6Waha A, Watzta M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriptase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998,8: 13-18.

7Atkins M, Strappe P, Laye S, et al. Quantittive differences in the distribution of zidovudin resistance muttions in multiple post-mortem tissues from AIDS patients. J Med Virol, 1998, 55: 138-146.

8Tetali S, Bakshi S, Than S, et al. Plasma virus load evluation in relation to disease progression in HIV-infected children. Aids Res Hum Retrovir,1998, 14: 571-577.

9Roth WK, Lee JH, Ruster B, et al. Quantification of hepatitis C virus RNA by RT-PCR in comparison to the branched DNA method. Z Gastroenterol, 1998, 36:5-11.

10Casanovas LJ, Silva G, Vargas RJ, et al. Vertical transmission of hepatitis c virus. An Esp Pediatr, 1997, 47: 627-632.

11沈敏，张庆五，谈秋雯，等. PCR定性及定量测定法测定血清HBV-DNA的评估. 胃肠病学，1999， 4：55-56.

12Cairns JP, Chiang PW, Ramamoorthy S, et al. A comparison between microsatellite and quantitative PCR analyses to detect frequent p16 copy number changes in primary bladder tumers. Clin Cancer Res, 1998, 4: 441-444.

13Traystman MD, Cochran GT, Hake ST, et al. Comparison of molecul