关键词： 分枝杆菌结核；抗药性；微生物；DNA突变分析

【摘要】目的研究耐多药结核分枝杆菌katG、inhA基因的变异机理。方法用katG、inhA基因片段为引物，聚合酶链反应扩增产物，克隆后制备质粒，直接测定DNA序列。结果15株耐异烟肼菌株均有katG基因突变，主要为点突变，其中14株有463位和315位AA密码子改变。在18个耐异烟肼菌株中，全部出现基因inhA基因变异，主要为点突变和缺失，以单个位点变异为主，各菌株变异不同。katG、inhA基因同时出现变异的比例高。结论结核分枝杆菌耐药基因变异复杂，我国耐多药结核菌株与国外的菌株katG、inhA基因变异特点不同。

Direct sequencing for katG and inhA genes of multi-drug resistant isolates of mycobacterium tuberculosis

ZHU Zhongyuan,CHEN Yiping, CHEN Yunfeng, et al.

（Workers′ Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, China）

【Abstract】ObjectiveTo characterize the katG and inhA genetic variations in multi-drug resistant isolates of M. tuberculosis. MethodsThe amplicons were cloned and sequenced by ABI 377 automatic sequencing system. ResultsAll isolates of M. tuberculosis with MIC for INH ≥1 μg/ml had point mutations and insertion in katG gene. Fourteen of 15 isolates (86.7%) had 463 codon (Arg→Leu) and 315 (Ser→Asn/Thr) mutations. Nine of 13 mutation positions were not reported previously. All 18 isolates with MIC≥1 μg/ml had one or more variations in inhA. The variations consisted of one or more base pairs deletions or point mutation. Each strain had its unique mutation. Seven of 10 isolates had both katG and inhA mutations. ConclusionGenetic variants of M. tuberculosis are significantly different from those of foreign strains.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis;drug resistance microbial;DNA mutational analysis

结核病的发病率和病死率在许多国家呈上升趋势，并出现耐多药结核分枝杆菌(结核菌)株，危害十分严重。从分子水平阐明结核菌耐药性变异的机理，可为建立敏感、快速和特异的检测方法奠定基础。katG基因全部缺失和点突变等引起结核菌产生对异烟肼（INH）耐药^［1,2］；将katG基因导入耐INH菌株可恢复其对INH的敏感性^［3］。表明katG基因与结核菌对INH的敏感性关系密切。其他研究也证实结核菌对INH和乙胺丁醇（EMB）的敏感性与inhA基因突变有关^［4］。我们采用直接测序法分析了从两城市结核菌耐多药株的katG、inhA基因，发现了多个新变异位点。

材料与方法

一、材料

1.菌株：结核菌H37Ra和H37Rv由湖北医科大学微生物学教研室提供。BCG从兰州生物制品研究所的卡介苗中分离。结核菌分离株68株。其中本院分离25株；武汉钢铁公司第二医院梅国华主任赠送38株；解放军187医院提供5株。

2.试剂和仪器：ABI 377型DNA测序系统和基因扩增仪为美国PE公司产品；BACTEC 460 TB型细菌检测仪和12B培养基为BD公司产品；pGEM T easy 载体为Promega公司产品；Dye Primer测序试剂盒为PE公司产品；聚合酶链反应(PCR)体系为华美生物工程公司产品。

二、方法

1.药敏试验：药物溶解后，除菌，注入12B培养基中，使INH和PAS的终浓度为1和10 μg/ml，利福平为50和250 μg/ml，链霉素为10和100 μg/ml，EMB为5和50 μg/ml。然后将生长良好的结核菌刮下，研磨成悬液，加入上述12B培养基中，并加1瓶不含药物的12B作为对照。结核菌浓度为1 μg/ml。37℃培养10天，每天在细菌检测仪测定生长指数，当试验瓶与对照瓶内的指数增长趋势一致时为耐药；相对稳定或呈下降趋势时为敏感。

2.DNA提取：溶菌酶和蛋白酶K裂解细菌后，苯酚氯仿纯化。

3.引物设计：katG、inhA基因的两对引物我们根据文献［1，2］（EMBL：x68081和Genbank: u02492）的序列自主设计，由中国科学院微生物研究所合成并纯化。KG1和KG2扩增katG基因2 681～3 721位碱基序列，长度为1 041 bp。IA1和IA2扩增inhA基因16～805位DNA片段，长度为790 bp，占inhA基因总长的96.1%。

4.基因扩增：100 μl反应体积内含2种引物各2 μl，PCR缓冲液10 μl，dTNPs(2 mmol)10 μl，模板5 μl，Taq 酶3 U，95℃预变性5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次，72℃ 7 min。

5.序列分析：根据文献［5］改进。PCR产物提纯后，与pGEM载体连接，转染给DH5α，经蓝白菌斑筛选和EcoRⅠ酶切鉴定，再制备质粒，纯化后与测序试剂反应、测序。正反方向测序，中间的50～100 bp双向均可测到。新变异位点都经重复试验证实。

结果

1.结核菌的最低抑菌浓度(MIC)：68株结核菌分离株中，20株为耐药株（29.4%）。其中耐1种药物1株（1.5%），耐2种药物4株（5.9%），耐2种以上药物15株（22.0%）。只有1株耐INH的MIC≤1 μg/ml。绝大多数为多耐药株。

2.katG基因变异：(1)14株耐INH的结核菌株中，均出现katG基因突变。1株MIC＜1 μg/ml也出现了katG基因突变。标准株和敏感株均未出现katG基因突变。(2)在katG基因的1 041 bp的片段中，变异位点13个，其中12个为点突变，包括转换和颠换，以前者为主。仅1个位点为碱基插入。249、270和406密码子为无义突变，250（Glu→Gly）、300（His→Pro）、418（Arg→Gln）、441（Pro→Leu）、456（Ala→Ser）及476（Ala→Val）密码子为错义突变。此9个变异位点为首次发现的变异位点。(3)每个耐药株均有1～4个碱基变异位点。除3株（占20%）为单个碱基变异外，其余均有2个或2个以上碱基变异。(4)变异频率最高的是3 366位G→T颠换，占80%（12/15）。其次为2 922位G→C转换或G→A颠换，占60%（9/15）。两者有一个或同时变异占86.7%（13/15）。3 405位碱基颠换在2株细菌中出现，其余位点变异仅在1株细菌出现。(5)13个碱基变异中，10个变异引起错义突变(missense mutation)，占76.9%，其余为无义突变（nonsense mutation)。

3.inhA基因变异：(1)在17株耐INH的菌株中，11株（64.7%）出现inhA基因变异。标准株和敏感株未发现inhA基因变异。对EMB和INH同时耐药的7株细菌，4株有inhA基因变异。(2)变异包括点突变（转换或颠换）和缺失。3株出现缺失的菌株，2株为单个碱基缺失伴点突变，另1株为75bp碱基缺失。(3)在11株变异菌中，7株为单个位点变异，2株为2个位点变异，3个和4个位点变异各1株。总共18个变异位点没有重复现象。(4)3个碱基变异为无义突变，10个为错义突变。75bp缺失使蛋白减少25个AA。其余2株缺失在138密码子出现终止密码子，肽链缩短131个AA。

4.katG、inhA基因共同变异：在同时测定katG、inhA基因的耐INH的10株结核菌中，有7株出现katG、inhA基因的同时变异，其余3株为katG基因变异，而无inhA基因变异。

5.不同地区菌株的变异比较：从海口分离的5株耐药菌，全部有katG基因3 366位碱基颠换（G→T）。有4株变异一致，从武汉和海口分离的各2株。唯一1株碱基插入的结核菌是从武汉分离的。

从海口分离的耐INH菌株中，出现inhA基因变异的4株菌，1株为单个位点变异，其他为2个或多个位点变异。而从武汉分离的7株有inhA基因变异的菌株，1株有2个位点变异，其余为1个变异位点。

讨论

自1992年开始研究katG、inhA基因基因变异以来，主要取得了以下成果：katG基因变异的机理包括katG基因完全或部分缺失、插入，更主要的是点突变。不同地区点突变的位置变化较大，只有katG基因463和315位AA的密码子突变的检出率较高。inhA基因变异的检出率相对较低。耐INH除了与katG、inhA基因有关外，还有其他基因突变。

将PCR产物纯化后与质粒载体连接，转染大肠埃希菌DH5α，后者大量繁殖的同时，质粒也随之繁殖。用碱裂解法提纯质粒，经EcoR I酶切， 通过琼脂糖电泳，如果有EcoR I的特异酶切位点，则出现PCR产物和载体两条电泳带，可与测序试剂反应，并经ABI 377自动DNA测序系统测序，不仅效率高，而且结果准确可靠。在测定了对15株耐多药结核菌的DNA序列后发现，我国的耐药株katG基因变异有如下特点：1是变异位点多。在1 041 bp的DNA片段中出现13个突变位点。有9个突变位点未见文献报道；2是耐INH菌株都可检测到katG基因突变，较Morris等^［6］报道的42株耐药菌中只有20株菌的katG基因有突变的检出率高；而与Musser等^［7］报告的耐药结核菌株都有katG基因变异的结果一致。3是463和315位密码子变异的频率是86.7%，比文献［7］报告的71%高。4是未发现全部或部分缺失，主要为点突变，个别为碱基插入。5是以错义突变为主，小部分为无义突变。与文献［6,7］报告的katG基因变异均为错义突变有区别。国内成光杰等^［8］和王晓川等^［9］只对katG基因扩增产物进行了SSCP分析。前者尽管在文中提及了对katG基因的测序研究，但全文没有碱基位点变异以及是否有AA改变的数据。<