关键词： 血小板；精氨酸；钙

【摘要】目的观察口服精氨酸对正常人血小板钙波动的影响并探讨其作用机制。方法选择10名至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康男性志愿者10例。年龄(26.7±3.6)岁，体重(67.9±5.0) kg。志愿者口服L-精氨酸4 d，每日20 g，分3次服用。用激光扫描共聚焦显微镜观察口服精氨酸前后单个血小板钙波动变化。结果服用精氨酸后，血清精氨酸浓度［(80.90±30.17) μmol/L和(200.19±42.99) μmol/L,P＜0.01］，血小板胞浆内环磷酸鸟苷浓度［(1.91±0.20) pmol/10⁹血小板和(2.14±0.34) pmol/10⁹血小板，P＜0.05］比服用前升高；二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低。结论口服精氨酸可以通过激活血小板的左旋精氨酸/一氧化氮通路，促进一氧化氮和环磷酸鸟苷的合成使二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低。

Oral L-arginine in reducing the peak value of platelet intracellular calcium oscillations induced by ADP

CONG Yulong

（Department of Medical Laboratory,）

JIN Zhao, LI Xiangfei,et al.

（Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of oral L-arginine upon the peak value of platelet intracellular calcium oscillations induced by ADP.MethodsTen male volunteers were selected ［mean age: (26.7±3.6) years; weight: (67.9±5.0) kg］. No drugs were taken during 2 weeks before study. Oral arginine was given for 4 days (20 g three times a day). Platelet intracellular calcium oscillations were observed by laser scanning confocal microscope before and after taking arginine.ResultsThe plasma levels of arginine ［mean±s, (200.19±42.99) vs (80.90±30.17) μmol/L, P＜0.01］ and platelet intracellular cGMP ［(2.14±0.34) vs (1.91±0.20) pmol/10⁹ platelets, P＜0.05］ were higher after taking arginine than before. The peak value of platelet intracellular calcium oscillations was diminished.ConclusionsOral L-arginine could inhibit platelet intracellular calcium oscillations induced by ADP through promoting NO and cGMP synthesis.

【Key words】Blood platelets;Calcium;Arginine

钙离子作为第二信使在血小板的活化过程中起到了重要的作用^［1］。血小板在诱导剂的作用下细胞内钙离子浓度(［Ca²⁺］i)升高并产生钙波动，同时激活了精氨酸/一氧化氮通路^［2］，我们对这两者之间的相互关系做了初步的探讨。

材料和方法

1.研究对象：选择至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康男性志愿者10例。年龄(26.7±3.6)岁，体重(67.9±5.0)公斤。受试者服药前抽血检测，然后口服精氨酸4 d，每日20 g，分3次服用，第4 d服用1次，3 h后抽血测试。

2.试剂：L-精氨酸碱(日本味之素公司)；二磷酸腺苷(美国Biopool公司)；Fluo 3-AM(美国分子探针公司)；无钙HEPES缓冲液(145 mmol/L NaCl；5 mmol/L KCl；1 mmol/L MgSO₄；5 mmol/L葡萄糖；10 mmol/L Hepes；pH调至7.40)，¹²⁵I-环磷酸鸟苷(cGMP)试剂盒(上海中医学院)，多聚赖氨酸(美国Sigma公司)。

3.仪器：Insight plus激光扫描共聚焦显微镜。

4.方法：(1)血清精氨酸浓度测定：抽取静脉血1 ml，3 500 r/min离心15 min分离出血清，按1∶1的比例将血清和磺基水杨酸混和振荡，14 000 r/min离心15 min，取上清液采用高分辨标准分析法测定血清精氨酸浓度。(2)cGMP浓度检测：将富含血小板血浆作血小板计数后，在37℃下加入终浓度为20 μmol/L的二磷酸腺苷诱导血小板聚集后3 000 r/min离心15 min，弃去上清，沉淀以pH 4.75的醋酸缓冲液悬浮，振荡，放入-20℃冰箱冻融3次，离心取上清液用¹²⁵I-cGMP试剂盒测定血小板cGMP浓度。(3)激光扫描共聚焦显微镜观察血小板钙波动：在培养皿底部钻一直径约1.5 cm的孔，粘上一张超薄载玻片，形成一小室，玻片包被0.4 g/L的Poly-lysine。取200 μl无钙HEPES缓冲液和2 μl血小板悬液加入小室，静置10 min后冲洗小室3次，最后加入含1 mmol/L Ca²⁺的HEPES缓冲液200 μl，在37℃水浴箱内预热3 min后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并记录加入二磷酸腺苷前后单个血小板的钙波动变化。

结果

1.血清精氨酸浓度：在服用精氨酸前血清精氨酸浓度为(80.90±30.15) μmol/L，服用精氨酸后升高至(200.19±42.99) μmol/L，P＜0.01。

2.血小板cGMP浓度：服L-精氨酸前血小板cGMP浓度为(1.91±0.20) pmol/10⁹血小板，服L-精氨酸后升高至(2.14±0.34) pmol/10⁹血小板，P＜0.05。

3.血小板钙波动变化：数据的处理按照规一化法做曲线，以开始时刻的荧光强度为一个单位量，图中纵座标代表加入二磷酸腺苷后血小板每一时刻胞内钙离子荧光强度(即钙离子浓度)与开始时刻荧光强度的比值，横座标代表钙离子荧光强度变化的时间过程。图中可见未加入诱导剂时血小板的荧光强度也表现出轻微的波动(图1)，这可能是因为(1)在标本的制备过程中血小板有些轻微的激活。(2)仪器的基线不够稳定。加入二磷酸腺苷后，细胞内［Ca²⁺］i以波动的形式升高，达到峰值的荧光强度是静息状态的2.5倍以上(图2)。服精氨酸后，血小板在二磷酸腺苷诱导下产生钙波动的振幅降低，［Ca²⁺］i达到峰值的荧光强度与静息状态的比值小于2.0(图3)。

图1静息状态血小板［Ca²⁺］i随时间变化的曲线

图2加入二磷酸腺苷后观察到的血小板钙波动现象

图3口服精氨酸后二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低

讨论

越来越多的研究表明非兴奋性细胞能够和兴奋性细胞一样表现出具有节律性的生物行为，这些行为是由细胞内的钙波动引起的。细胞外的钙离子进入细胞内或细胞内钙库释放钙离子都可以引发钙波动，表现为胞浆内钙离子浓度周期性地升高和降低。

钙波动的形式多样，不同的细胞有不同的形式，同一种细胞在不同的诱导剂作用下也可以产生不同样式的波动。钙波动的机制也未完全明了，具有代表性的有以下几种学说^［3，4］：(1)三磷酸肌苷(IP₃)-单钙贮存池学说：细胞内的某个或某些细胞器(如内质网、肌浆网、血小板的致密管道系统)含有丰富的钙离子，在受到刺激后通过释放大量钙离子进入胞浆或摄取胞浆钙离子等方式参与钙离子的调控，这就是钙贮存池。本学说认为细胞内只有一个钙贮存池-IP₃敏感池参与钙波动形成。受体激活磷脂酶C，生成IP₃，IP₂与IP₃敏感池的受体结合，使钙池上的钙通道开放，释放大量钙离子进入胞浆，［Ca²⁺］i升高，进一步激活磷脂酶C形成正反馈，同时IP₃又被磷酸酶分解成IP₂。钙泵将胞浆内的钙离子泵回钙贮存池使［Ca²⁺］i下降。当钙池内钙离子浓度到达一定程度时，又一次在IP₃的作用下释放钙离子，开始下一循环。(2)双钙贮存池学说：该学说认为IP₃并不是引起细胞内钙释放的唯一机制，在细胞内同时存在着IP₃敏感池、IP₃不敏感池和钙离子诱发的钙释放机制。IP₃激发IP₃敏感池释放钙离子，钙离子被IP₃不敏感池摄取，当该池充满后就以钙离子诱发的钙释放方式释放钙离子至胞浆，这两个步骤不断循环产生钙波动。(3)钙调蛋白-单钙贮存池学说：激动剂与受体结合后，在G蛋白的介导下激活磷脂酶C，生成IP₃，IP₃与钙贮存池上的受体结合促使其钙通道开放，释放大量钙离子入胞浆，形成钙尖峰。同时［Ca²⁺］i升高促使钙通道上的钙-钙调蛋白复合物形成，抑制其开放，钙离子释放减少。钙贮存池膜与细胞膜的钙泵分别将胞内的钙离子泵回贮存池或泵出细胞，对钙通道的抑制以及这两个钙泵的共同作用使［Ca²⁺］i下降，［Ca²⁺］i降低到一定程度时，钙-钙调蛋白复合物减少，钙贮存池膜钙通道的抑制被解除，通道重新开放，钙波动进入下一周期。此学说也不需要假设存在IP₃波动。

本实验表明正常人服用精氨酸后，血中精氨酸浓度及血小板胞浆内cGMP浓度明显升高，二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动的峰值降低。

二磷酸腺苷可以通过打开血小板细胞膜上的钙离子通道引发胞外钙离子内流，同时也可以激活磷脂酶C，产生IP