短串联重复序列(STR)又称微卫星DNA，它是由2～7个碱基对作为核心单位串联重复形成的一类DNA序列。 STR出现的数目和频率的变化构成了STR遗传多态性。LDL受体基因第18外显子3′末端非翻译区上一段短串联重复序列(dTA)n 在人类存在多态性^［1］。 我们应用聚合酶链反应(PCR)，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)建立了检测相差2bp DNA碱基对的银染方法。

一、材料和方法

1.材料：PCR缓冲液，Taq酶，dNTP，引物，PCR仪，电泳仪，垂直电泳槽及电泳板。银染试剂为国产分析纯，试剂均用去离子三蒸水配制。

2.方法：取家族性胆囊结石家系成员静脉血，以依地酸（EDTA）抗凝，按PUREGENE试剂盒提供的高盐沉淀法，提取基因组DNA，完成DNA片段扩增。 引物序列如下：P1：5′CACTGAACAAATA-CAGCAACCAGGG 3′，P2：5′CACTTTGTA-TATTGGTTGAAACTGT 3′。10 μl PCR体系包括：模板DNA 5 μl(10 ng/μl)，10(PCR缓冲液1 μl(1.5 mmol/L MgCl₂)，引物0.12 μl(200 nmol/L)， Taq酶0.05 μl， dNTP 0.4 μl，灭菌去离子水3.31 μl。 PCR共35个循环；72℃延伸7分钟。

3.扩增产物的检测：配制10%PAGE(厚1 mm)，其中含7 mol/L尿素，丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例为19∶1。电泳以1×TBE为缓冲液，PCR产物3 μl加3 μl 2×载样缓冲液，恒压180V电泳。电泳结束将凝胶移至塑料容器内。10%乙酸固定10分钟，1%硝酸氧化5分钟，0.012 mol/L硝酸银(含甲醛1 ml/L)染色30分钟，以上每步骤间均水洗2次。0.28 mol/L Na₂CO₃(含甲醛500 μl/L，硫代硫酸钠0.2 mg/L) 显色至条带清晰，10%乙酸2分钟终止反应，判读结果。

二、结果

LDL受体基因第18外显子的(dAT)n多态位点存在3种等位基因：A等位基因106bp，B等位基因108bp，C等位基因112bp，相应有6种基因型：AA，AB，AC，BB，BC，CC，其中A，B等位基因仅以2bp碱基对区分。

三、讨论

PAGE核酸的银染方法经Brant等^［2］提出，他们用HaeⅢ内切酶消化噬菌体ΦX174双链DNA后进行PAGE，分离出的片段进行银染时发现，在硝酸银溶液中加入还原剂甲醛可以提高染色灵敏度，银的络合剂硫代硫酸钠则可降低背景染色。我们的工作证实硝酸银，甲醛，硫代硫酸钠，胶的浓度和厚度直接影响银染方法的分辨力。

影响银染硝酸银质量最重要，应注意避光。潮解，发黑不宜使用。硝酸银溶液临用前配制。甲醛浓度影响银染效果，浓度一般为500 μl/L。甲醛浓度较高时胶颜色发黄，背景污浊；浓度较低不仅染色时间延长而且不易着色。硫代硫酸钠作为银的络合剂，可减少非特异染色，其用量过多胶颜色发黄，过少则不足以鳌合掉游离的银离子，胶颜色发黑，一般为0.1～0.2 mg/L。如果显色进程难以控制，可将显色剂Na₂CO₃溶液(临用前配制)预冷至10℃，在硝酸银溶液染色水洗后先用少量Na₂CO₃溶液浸胶，出现棕黑色后立即弃去溶液，再加入10℃ Na₂CO₃溶液显色至满意的条带出现。

胶的浓度和厚度也与染色效果有关。胶的浓度低于10%时，分辨力降低，难以分辨出2个碱基的差别；浓度过高时，不仅电泳时间需要延长，而且银染后条带不清晰。染色不足时，可用三蒸水漂洗后从染色步骤开始，再染一次。切记在染色过程中应小心操作，保证聚丙烯酰胺胶完整。注意银染所用的塑料容器应洁净，以减少银离子的附着。

该银染方法不需特殊试剂和仪器，简便易行，结果直观，还可以复印，摄影保存。一般的临床实验室均可开展。

参考文献

[1]Zuliani G, Hobbs HH. Dinucleotide repeat polymorphism at the 3′end of the LDL receptor gene. Nucleic Acids Res, 1990,18:4300-4305.

[2]Brant JB, Gustavo CA， Peter MG. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991,196：80-83.

（收稿1999-03-10修回1999-06-03）